罗丹明衍生物和类似物已广泛用于不同的超分辨率成像技术，尤其是光活化定位显微技术（PALM）。这些罗丹明衍生物和类似物中，罗丹明螺内酰胺因为在光变色转换过程中具有理想的光暗对比度，所以在PALM成像方面表现出极大的优势。虽然研究者早就开始对罗丹明螺环内酰胺进行修饰，但是几乎没有人考虑到PALM成像的一个重要特征——光变色转换工作时间。在PALM成像中，空间分辨率和时间分辨率之间总是不能同时满足。

图1. a)常见罗丹明螺环内酯的光致变色机理，如Rh-PHT和Rh-MGly；b) 锌离子型罗丹明螺内酯的光致变色机理；c)肖义教授团队光致变色机理，Rh-Gly（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了更好地理解酸度对螺环内酰胺或两性离子存在的影响，作者测定了Rh-Gly和类似物Rh-MGly在相同条件下的pKa。结果表明，Rh-Gly转化为相应的两性离子不需要强酸性条件，并且两性离子可以通过“自稳定”结构在一定程度上得到稳定。这种稳定延长了两性离子的寿命，有助于提高Rh-Gly的光激活效率。

 图2. a) 罗丹明螺环内酰胺的自发环化平衡；b,c) Rh-Gly发射光谱和pH的关系（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

因为罗丹明螺环内酰胺在中性介质中不断自发开环，Rh-Gly的弱酸性pKa保证了其大部分荧光团在生理条件下以非荧光螺环内酰胺的形式存在，从而避免了活细胞PALM成像过程中信号重叠。

作者还对Rh-Gly的光激活条件和单分子荧光工作时间进行了研究。与类似物Rh-MGly和早前报道的PALM染料Rh-Pht相比，Rh-Gly在单分子水平上延长工作时间表现出可重复性和紫外激活可控性。羧基对两性离子的稳定作用不仅增加了总光子的聚集，而且提高了单分子的亮度。

图3. Rh-Gly的光活化、单分子荧光的实时测量及与类似物的比较（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

  紧接着，作者研究了Rh-Gly对活细胞线粒体的PALM成像情况。研究结果表明：Rh-Gly在不同的细胞系(HeLa和MCF-7)中也显示出一种特殊的线粒体染色特性。由于工作时间的延长，Rh-Gly的活细胞线粒体PALM成像的瞬时分辨率被缩短到10秒的同时，还保留了大约25 nm的定位精度。空间分辨率和时间分辨率之间的平衡使得Rh-Gly可以用于获得更多活细胞线粒体的高质量超分辨率图像。此外延长的工作时间使得Rh-Gly具有获得更宽广的单分子运动轨迹的潜力。

图4. Rh-Gly的双色共域分析（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

图5.在活体HeLa中线粒体富集区的超分辨率成像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者还分别使用HaloTag配体衍生物和异硫氰酸酯衍生物（NCS）修饰Rh-Gly，使得Rh-Gly可以标记特殊细胞。通过自标记蛋白标签，HaloTag配体修饰的Rh-Gly可以用于histone H₂B蛋白在活的HeLa细胞中的超分辨率成像；通过免疫染色抗体标记法，异硫氰酸酯（NCS）修饰的Rh-Gly可以在被固定的细胞中实现微管的超分辨率成像。

图6. 组蛋白的超分辨率成像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

图7. 微管超分辨率成像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结：不同于以往利用罗丹明染料的螺环对pH，RNS/ROS等响应，大连理工大学肖义教授团队设计了一种新的罗丹明螺环内酰胺染料Rh-Gly解决PALM成像中工作时间问题，发展了一种简单而有效的延长光致变色罗丹明螺内酰胺工作时间的策略，有利于PALM成像。通过在靠近内酰胺的位置引入一个羧基，发挥内酸性作用，稳定了光产生的两性离子。Rh-Gly在单分子水平上表现出可重复和紫外可控的激活能力，延长了两性离子的时间。羧基对两性离子的稳定作用不仅增加了总光子的收集量，而且提高了单分子的亮度。此外，Rh-Gly在不同的细胞系(HeLa和MCF-7)中也有特异性的线粒体染色。随着时间的延长，活细胞线粒体PALM成像的时间分辨率缩短到10 s，定位精度保持在25 nm左右。由于时空分辨率的平衡，Rh-Gly进一步获得了活细胞线粒体的一系列超分辨率图像。HaloTag配体衍生物和异硫氰酸酯衍生物扩展了Rh-Gly对特定细胞标记的功能；通过自标记蛋白标记和免疫染色方法，这些衍生物能够对HeLa细胞中的组蛋白和微管进行高分辨率成像。因此，肖义教授团队的工作为今后罗丹明螺环内酰胺的开发提供了一条新的途径。

撰稿人：犟子柳