（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

多个生物标志物的实时同步成像不仅为研究生物体内某一病理通路内不同生物标志物之间的基本相关性提供了独特的机会，而且提高了疾病诊断的准确性。可激活的荧光探针因其对目标生物标志物具有较高的敏感性和特异性，已成为医学上有价值的工具。然而，目前用于双生物标志物成像的研究还很少，更不用说多生物标志物成像了。由于这些探针通常依赖于两种荧光分子的各自激活导致发射光谱重叠而常常发生信号串扰，这可能会影响生物标志物的分辨率。与荧光探针相比，化学发光(CHL)探针由于消除了实时光激发，使得背景噪声最小。然而，大多数CHL底物在生理条件下都有微弱的发光。

为改善化学发光和荧光在双生物标志物成像的不足，南洋理工大学浦侃裔课题组合成了双生物标志物成像的单分子化学/荧光报告剂（CFR）。CFR可以用于DIH成像。由于氧化应激和细胞凋亡在炎症反应和肝功能衰竭出现之前的DIH早期就被发现上调，因此选择O₂^•−和casp3作为CFR设计的早期生物标志物。CFR是第一种具有两个独立激活通道的光学小分子探针：用于检测casp3的近红外通道(NIRF)；用于检测O₂^•−化学发光通道（CHL）。NIRF部分是通过修饰半花菁的羟基实现的。能被casp3切除的多肽[Asp-Glu-Val-Asp]通过可自消除的连接基团修饰到半花菁上。CHL部分是通过可以被O₂^•−切除的三氟甲基磺酸（Tf）修饰的苯酚实现的。casp3的存在导致肽段与CFR的自消除连接基团之间的酰胺键断裂，然后通过1,6-消除自发生成半花菁，产生荧光。与产生荧光信号不同的是，化学发光信号是O₂^•−攻击CFR的磺酸酯产生的。O₂^•−攻击CFR的磺酸酯后，诱导Tf基团去保护，产生高度不稳定的苯酚-二氧乙烯衍生物。苯酚-二氧乙烯衍生物是一个中间产物，这个中间产物经历了自发的分解，并释放出光子，产生CFL信号。

为了研究CFR的光学性质和传感能力，南洋理工大学浦侃裔教授课题组研究了在没有或同时存在这两种生物标志物的条件下 CFR的吸收光谱、NIRF光谱和CHL光谱的情况。

 （图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

CFR在610 nm和660 nm处具有最大紫外吸收峰，几乎没有荧光或化学发CFR与casp3孵育后，由于肽段的裂解和半花菁的生成，CFR在690 nm处出现新的吸收峰，而HPLC证实了半花菁的生成。casp3对肽段的裂解使得NIRF在710 nm的荧光增强了12倍。在O₂^•−存在的情况下，CHL信号在540 nm处被激活，此时CFR的吸收和NIRF的光谱性质几乎没有改变。O₂^•−诱导的的CHL是背景光的40000倍。这些数据表明，CFR分别通过NIRF和CHL的信号，灵敏特异的检测casp3和O₂^•−。

基于CFR光谱性质的研究情况，他们将CFR用于小鼠肝细胞双成像。用药物丙戊酸（VPA）处理细胞，结果证实了CFR在活细胞中对casp3和O₂^•−成像的可行性。

 （图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

随后，他们在DIH小鼠模型上进一步研究CFR用于双成像的能力。CFR的体内双信号演化趋势与体外结果相似。用VPA处理的小鼠，线粒体功能混乱，随后过度产生O₂^•−。ROS水平升高会导致DNA损伤和线粒体通透性转变，激活casp3。最后，细胞凋亡发生，导致细胞死亡和组织损伤。因此，CFR的双信号演化和DIH的机理一致，这进一步证实CFR在发生DIH时可以纵向和差异地检测到O₂^•−和casp3的上调。

 （图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结：南洋理工大学浦侃裔教授课题组设计了一种双模态成像探针CFR,并证实了该探针可用于DIH的早期诊断。该探针具有两个独立的光通路，可以互不干扰的对O₂^•−和casp3灵敏特异的检测。CFR对DIH的临床前药物筛选和临床诊断具有重要的应用前景。CFR是第一种具有光激发和化学发光的双成像小分子探针。这种CFR分子设计可以简单地通过改变CHL和NIRF信号转导位点上的 帽子基团，推广到其他生物标志物的双成像。

撰稿人：犟子柳