先前的实验研究表明，一些罗丹明的非辐射衰变与TICT态的形成密切相关。因此，抑制可能的TICT形成是开发新的罗丹明衍生物的重要策略之一。在TICT状态下，供体部分相对于荧光团核发生一个约90°的旋转，变得无辐射和高度反应。为了抑制TICT，过去常常通过形成环状结构使二烷基氨基供体分子刚性化。不幸的是，这种方法常常导致大分子结构生物相容性差。大连理工大学肖义、杨伟课题组和新加坡科技设计大学刘晓刚课题组用一个简单的季铵哌嗪基取代四甲基罗丹明(TMR)中的二甲氨基。由此产生的N,N-二甲基哌嗪取代的罗丹明(MPR)使TMR的亮度加倍，并保持了良好的生物相容性。

染料中TICT的形成本质上受两个因素控制:空间位阻和电子推拉效应。他们认为降低氨基的供电子强度会破坏TICT状态的稳定，从而加强进入TICT状态的能量屏障，可以抑制TICT的形成。因此注意到一个具有吸电性的季铵哌嗪基，带正电荷的铵具有诱导作用，降低了邻近氨基的供电子能力。那么用季铵哌嗪基取代二甲氨基应该能最大限度地减少TICT的形成。

之后通过计算一系列氨基分子的垂直电离能(VIEs)来支持了上述推论。TMR和MPR在水中势能的结果表明，TICT的形成面相对于TMR (0.42 eV)具有更大的能量屏障蛋白(0.50 eV)。此外，在MPR (0.15 eV)中，驱动能量从局域激发态(LE)进入TICT状态远小于TMR (0.60 eV)。因此，MPR形成TICT的可能性应小于TMR形成TICT的可能性。这些理论计算支持作者通过实验验证了季铵哌嗪在提高罗丹明亮度方面的策略。因此通过之前报道的哌嗪罗丹明的有效N-烷基化反应合成了MPR。光谱研究表明,MPR在水溶液中相比 TMR(Φ= 0.47;ε= 7.8×10⁴ M⁻¹cm⁻¹)显示出量子产率(Φ= 0.93) 显著提高和摩尔消光系数(ε= 8.7×10⁴ M⁻¹ cm⁻¹) 显著增加。

图1. (a)导致发射态和非发射态的势能剖面示意图。(b)真空中各氨基的垂直电离能。(c) TMR和MPR在水中的势能面。(d)季铵哌嗪荧光团及其二甲胺类似物的光谱特性。（图片来源： J. Am. Chem. Soc.）

之后作者进一步比较了单分子水平上MPR和TMR的荧光。通过羧基位置相同，MPR和TMR均与免疫球蛋白G (IgG)偶联，并吸附在表面上，因此可以研究它们在水溶液条件下的单分子特性。两种化合物的单分子分布很稀疏，避免了重叠。与TMR-IgG相比，MPR-IgG的单分子亮度(518±63)、总收集光子数(4.06±0.26)×10⁴)、信噪比(信噪比:8.51±0.32)、定位精度(10.08±0.19 nm)均有显著提高。这些结果与系综光谱研究和量子化学预测相吻合。此外，在PBS和图像增强缓冲液中，在一系列条件下证实了MPR-IgG的增强光子效果。仿真研究表明，与TMR-IgG相比，MPR-IgG显示了改进的基于局部化的超分辨率成像潜力。这些结果表明，季铵哌嗪策略有效地提高了罗丹明的亮度。

为了研究季铵哌嗪在超分辨率成像中的应用，作者在HeLa细胞中加入了免疫染色的微管。重建后的图像出现了微管的扭曲和交叉，与传统图像相比，表现出了相当大的清晰度增强。对成像结果的比较表明，MPR的超分辨率成像能力优于TMR。

图2. 将MPR和TMR的羧基衍生物偶联到IgG分子上后的单分子荧光信号、荧光轨迹及分子特性。MPR-IgG和TMR-IgG单分子亮度在PBS (pH = 7.4)溶液中随激光功率的变化。（图片来源： J. Am. Chem. Soc.）

为了进一步探讨MPR在活细胞中的适用性,作者设计了一个双探测器——Mem-R(Φ= 0.64)来特殊性标记质膜，然后使用Mem-R对细胞膜进行超分辨率成像。重建后的图像显示了细胞膜的详细结构，与传统模糊图像形成鲜明对比。进一步分析重建后，估计平均单分子亮度为984，平均定位精度为20.9 nm。作者注意到，Mem-R的单分子亮度可以与DiI(一种基于Cy3的商用膜跟踪器)相当，这应该归因于Mem-R的量子产量比DiI高得多。此外由于Mem-R优异的光物理特性，使得高密度单分子跟踪实验成为可能，也揭示了Mem-R在质膜上的非均匀扩散。这些结果表明，Mem-R可以对细胞膜进行高质量的超分辨率成像。

图3. Mem-R的分子结构以及Mem-R染色的活HeLa细胞质膜超分辨率图像。Mem-R在(b)中标记区域的高密度分子跟踪，根据扩散系数对轨迹进行着色（图片来源： J. Am. Chem. Soc.）

探针Lyso-R具有溶酶体靶向性且大部分是非质子化的，在中性pH下荧光强度较低，其质子化(pk1/2 =6.56)的结果是形成了一个高荧光的Lyso-RH，实现了季铵哌嗪策略。为了证实Lyso-RH的靶向性，使用溶酶体标记蛋白(Lamp-1)对活的HeLa细胞进行衍射受限共聚焦分析。在正常培养基下，活细胞溶酶体中反复出现暂时性分离信号。统计分析表明，Lyso-RH光开关的亮度超过了商用的Lysotracker Red探针。重建的图像显示了球状溶酶体的真实形状和大小，与衍射受限的图像相比，其清晰度显著提高。在超分辨率图像中，溶酶体的宽度测量为70.3 nm，与电子显微镜报道的值相匹配。重建量化分析显示与之前报告的结果相比较，空间分辨率高。此外，由于溶酶体中Lyso-RH在没有过量图像增强剂的情况下也具有持久的光敏作用，实现了长期的超分辨像，显示了溶酶体在高空间分辨率下的异质运动。

图4. Lyso-R的质子化在酸性溶酶体中原位生成Lyso-RH。以及 Lyso-RH染色的HeLa细胞溶酶体的超分辨率和常规图像，彩色超分辨率图像。（图片来源： J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者探讨了季铵哌嗪策略的推广性。量子化学计算预测，这种策略可以运用到其它荧光团上，如萘酰亚胺和NBD染料，随后的实验表明亮度提高了77倍。

总结：综上所述，大连理工大学肖义、杨伟团队和新加坡科技设计大学刘晓刚团队提出并证明了一种新的提高罗丹明染料亮度的策略，即以季铵盐哌嗪为供体片段，降低推拉效应，抑制扭曲的分子内电荷转移。新设计的MPR与传统的TMR相比，亮度提高了1倍。在MPR的基础上，进一步开发了细胞膜探针Mem-R和溶酶体探针Lyso-RH。其优异的荧光特性使其在单分子跟踪和超分辨率成像实验中获得了成功的应用。这种季铵盐化策略将会激发许多高性能荧光团和探针的发展，并极大地促进荧光成像技术的发展。

撰稿人：冯虹