光异构化反应由于其灵敏的感光生物学功能，被广泛的应用于化工领域，如光学数据储存、分子转换。光异构反应中，以双键顺反异构化最为常见。共轭体系如绿色荧光蛋白(GFP)双键的异构化有两种途径，单键翻转（OBF）和键角扭转（HT）（Figure 1）。OBF途径只有τ键旋转，而HT途径相邻的φ键随着τ键旋转，OBF途径的原子轨道所需要的体积比HT途径大。因此，OBF途径常发生在允许自由运动的环境中，而HT途径常发生在空间受限的环境中。

为了探寻绿色荧光蛋白(GFP)双键光学异构化的途径，作者以rsEGFP2（可逆转换增强绿色荧光蛋白2） 为模型进行检测。rsEGFP2具有易结晶的特点和良好的光学特性。β-桶状折叠的rsEGFP2发光团自然条件下呈现顺式构象，在488nm的激光照射下很容易异构化为反式构象，相反，在405nm的激光照射下，反式构象异构化回顺式构象。rsEGFP2还有一个显著的优点，rsEGFP2很容易被基团取代用来区分OBF和HT途径。在野生型细胞中，rsEGFP2通过两种途径产生相同的反式产物。但如果取代基破坏rsEGFP2酚环的对称性，两种途径就会产生不同的产物。当带有取代基的cis rsEGFP2发生OBF途径时，变为trans syn，发生HT途径时，变为trans anti（Figure 2B）。通过琥珀抑制使3-氯酪氨酸替换67残基处的酪氨酸，生成一个邻位氯取代的酚氧色团。此变体Cl-rsEGFP2与野生型rsEGFP2有类似的光敏特性(Table S1)。

(图片来源：J. Am. Chem. Soc.)

(图片来源：J. Am. Chem. Soc.)

以发光团cis状态为准，氯取代基处于anti的方向(Figure 3A)。当发光团异构化为trans，氯取代基处于syn的方向，并且Cl-rsEGFP2的两个环不再平行（τ = 12°, φ = −13° in cis; τ = 187°, φ = −32° in trans  τ 为N−C=C−C1二面角，φ 为 C=C−C1−C6二面角）（Figure 2B），另外，空间构象轻微扭曲形成新的反式构象，酚羟基不再与His149形成氢键，而与水分子形成氢键。His149与Tyr146形成氢键(Figure 3A)。

   作者统计比较了一些Cl-rsEGFP2的晶体数据，发现一些晶体的单位尺寸大小比之前报道的小7%，众所周知，当水进入或离开单个蛋白质之间的溶剂通道时，蛋白质晶体会膨胀或收缩。实验操作的微小变化会导致Cl-rsEGFP2的溶剂含量变化。作者发现可通过将Cl-rsEGFP2晶体浸泡在相对湿度较低的低温保护剂中，来控制降低Cl-rsEGFP2的晶格间距。低温保护剂可将水从晶体中抽出，使之更紧密聚集在一起，从而得到“收缩”晶体。当Cl-rsEGFP2收缩成更紧密的晶格时，其折叠方式不变，但尾部和环路区域出现了轻微偏差。蛋白质在cis状态下收缩晶体与膨胀晶体的内部几何构型相同，trans状态下收缩晶体与膨胀晶体相比空间结构明显扭曲。有趣的是，trans状态下收缩晶体Cl-rsEGFP2的两个环平行，且与与His149形成氢键(Figure 3B)。这种现象在多个晶体中都有发现。Cl-rsEGFP2的晶体结构表明，晶格的微小重排可以改变光异构化途径。由于顺反异构化反应对介质的空间结构很敏感，膨胀晶体常以OBF途径异构，而收缩晶体则以HT途径异构。

(图片来源：J. Am. Chem. Soc.)

Kao等人以Dronpa（可逆光致变色荧光蛋白）为研究对象，观察到介质粘度增加会减慢Dronpa的光敏速率，无论是溶剂粘度还是晶体填料都会影响发光团异构化，表明发光团的异构化与蛋白质的β-桶状折叠运动是耦合的。本文作者研究结论与其相似。Cl-rsEGFP2的结晶条件可能会干扰蛋白质的结构并引起功能后果。众所周知，蛋白质的向外残基和柔性环在晶体内可能相互作用引起结构改变，而蛋白质内部很少受到影响。而本文中，trans Cl-rsEGFP2的晶体结构单位体积收缩7%时，出现了明显的结构改变，说明晶体填充的相互作用影响了trans Cl-rsEGFP2内残基的构象。

小结：本文详述了Cl-rsEGFP2晶体顺反异构化的机理。显然，蛋白质异构化的途径不是蛋白质所固有的，而是取决于蛋白质在晶体中的构象。膨胀晶体常以OBF途径异构化；单位体积收缩7%的收缩晶体常以HT途径异构化。研究发现发光团的异构化与蛋白质的β-桶状折叠运动是耦合的。在不同的荧光蛋白中，异构化的机制可能不一样。研究结果表明结晶条件可能会导致蛋白质面向内的残基结构重排。