图1.同时对细胞质粘滞度和羟基自由基成像示意图

（图片来源J. Am. Chem. Soc.）

铁死亡是2012年发现的一种不同于经典的caspase依赖性凋亡途径而调节细胞死亡的方式。铁死亡依赖于铁离子，会发生脂质过氧化。脂质过氧化物的积累是导致细胞死亡的主要原因。研究发现，铁死亡过程中脂质过氧化与活性氧有关，但是哪种活性氧发挥关键作用还不清楚。羟基自由基作为活性最高的活性氧是否在铁死亡过程中造成脂质过氧化还缺少相关研究。

细胞内粘滞度是生物活性物质扩散和信号传递等多种细胞过程的基本因子。细胞粘滞度的异常变化可能与某些疾病有关。此外，胞质粘滞度增加是细胞收缩和胞质浓缩导致的凋亡的重要形态学特征。由于铁死亡在形态学上与凋亡不同，因此揭示铁死亡是否与细胞粘滞度改变有关具有重要意义。

目前的荧光探针只能单独检测羟基自由基产生或细胞质粘滞度变化。这使得检测过程复杂，也无法准确揭示羟基自由基与细胞质粘滞度在铁死亡过程中的关系。因此，马会民课题组开发了荧光探针(H-V)实现了对铁死亡过程中羟基自由基和细胞质粘滞度的同时成像。

作者利用分子转子策略和芳环羟基化设计出探针H-V。分子转子有两个对称的小π-共轭。在分子转子中，吲哚部分是电子受体，苯甲醚是电子供体，它们是通过可旋转的乙烯基键形成D-π-A结构连接起来的。随着微环境粘滞度的增加，分子内旋转受到限制，从而抑制了非辐射过程中分子内扭转电荷转移，导致探针荧光增强。另一方面，芳环的羟基化被用来提高检测•OH的选择性，而强供给电子基（甲氧基）的加入能够增强探针对•OH的捕获能力，提高检测灵敏度。此外，探针H-V中还引入了两个磺酸盐基团来中和正电荷。在H-V的donor-two-acceptors结构中， •OH造成的羟基化主要发生在甲氧基的间位上，形成苯酚中间体，然后发生去质子化和电子重排,最终形成一个大π共轭系统(product 1)。从探针H-V到product 1光谱发生很大的红移，并且有很鲜明的近红外荧光变化，从而实现用独立的通道检测•OH，避免了粘滞度检测通道的交叉信号。

图2. H-V对粘滞度和羟基自由基响应的机理

（图片来源J. Am. Chem. Soc.）

在探针被合成出来之后，作者首先研究了探针H-V对粘滞度的响应情况。探针H-V的紫外吸收在400 nm,而在520 nm处有微弱的荧光发射。作者以甲醇甘油体系模拟粘滞度，研究发现随着粘滞度的增加，520 nm处的荧光显著增强。在纯甘油中的荧光比在纯甲醇中的荧光增加了50倍。这表明探针H-V对粘滞度非常敏感。随后，作者研究了探针H-V对•OH的响应情况。作者用芬顿反应提供•OH。随着芬顿试剂的增加，在652 nm处的荧光显著增强，最高增强了450倍。而在其他活性氧的反应中，并没有明显的荧光增强。这表明探针H-V对•OH有非常高的选择性。

图3. 探针对粘滞度和羟基自由基响应的荧光变化

（图片来源J. Am. Chem. Soc.）

在研究了探针H-V对粘滞度和•OH的响应情况之后，作者利用探针H-V进行活细胞的•OH和细胞质粘滞度的独立成像。有报道表明随着培养温度的降低，细胞质粘滞度升高。成像结果表明，绿色通道的荧光强度随着孵育温度的降低而增强，而红色通道的荧光强度没有变化。这些结果表明，H-V能特异性地成像细胞质粘滞度的变化。另一方面，•OH成像结果显示，红色通道的荧光强度时，绿色通道荧光强度无显著变化。这表明，H-V适用于细胞内•OH的独立成像。

图4. 探针对细胞质粘滞度和羟基自由基的独立成像

（图片来源J. Am. Chem. Soc.）

在独立成像的基础上，作者研究了在铁死亡过程中，探针H-V对细胞质粘滞度和•OH的成像。作者利用erastin诱导细胞铁死亡，收集两个独立通道的荧光信号，同时监测细胞内•OH的特异性变化和粘滞度变化。随着erastin孵育的时间增长，红色和绿色通道的荧光强度都增强，而使用铁死亡抑制剂（DFO，Fer-1，Lip-1）后，荧光强度受到显著抑制。上述结果表明，铁死亡伴随着胞浆粘滞度增加和•OH生成。

图5.铁死亡中H-V对细胞质粘滞度和•OH的成像

（图片来源J. Am. Chem. Soc.）

总结：中科院马会民课题组用双功能荧光探针H-V监测铁死亡过程中细胞内•OH和粘滞度的变化，首次实现使用单一探针同时监测铁死亡中•OH和粘滞度的变化并揭示了铁死亡伴随着羟基自由基产生和细胞质粘滞度增加。