近日，山西大学分子科学研究所阴彩霞教授课题组合成了探针Ly-NT-SP，用于溶酶体中SO₂的检测。探针Ly-NT-SP在pH 5.0的PBS溶液中在535 nm有明显的荧光发射。紫外光照射后，Ly-NT-SP中的螺吡喃基团异构化为半花菁形式（Ly-NT-MR），其荧光发射峰红移至630 nm。此外，光控的Ly-NT-SP到Ly-NT-MR的异构化反应生成了一个C=C-C=N⁺基团，该基团能够与SO₂发生Michael加成反应，加成产物在535 nm处具有明显的荧光发射。体外研究表明，光活化Ly-NT-MR对SO₂具有显著的选择性，检出限为4.7 μM。该探针首次成功地应用于热休克过程中溶酶体内SO₂浓度变化监测。（DOI:10.1021/jacs.9b13936）

紫外光照射后，螺吡喃（SP）的结构可以可逆地转变为半花菁（MR）态。由于萘酰亚胺给体与MR受体之间存在共振能量转移（FRET）过程，可以观察到绿色荧光到红色荧光的“红移”荧光响应。特别是紫外激活的MR态包含一个特殊的碳碳双键，该双键可受到SO₂的原位进攻。这种原位紫外激活策略使作者能够以比率测量的方式准确监测溶酶体中的SO₂，这在很大程度上避免了探针在细胞中假阳性信号的干扰。

图1. Ly-NT-SP的分子设计，SO₂的传感机制以及在紫外辐射控制下的原位反应示意图。(图片来源：J. Am. Chem. Soc. )

探针Ly-NT-SP在PBS溶液中的荧光发射在535 nm处。作者发现，紫外照射120 s之后，探针荧光光谱中535 nm处的最大发射红移到630 nm。紫外吸收光谱中，随着紫外光照射时间的增加，探针在540 nm处出现一个新的吸收峰。以上光谱变化表明紫外光控制探针由Ly-NT-SP向Ly-NT-MR的转变是有效的，同时该转化过程伴随着由萘酰亚胺荧光团到半花菁荧光团荧光共振能力转移过程。随后作者测试了探针Ly-NT-MR在SO₂存在下的荧光光谱和紫外可见吸收光谱变化。加入Na₂SO₃（作为SO₂供体）后，在荧光光谱中，探针630 nm处的发射带向前移动至535 nm；紫外吸收光谱中，540 nm处的Ly-NT-MR吸收带随之逐渐减小。

 图2. 探针Ly-NT-SP用紫外光照射120 s以及加入Na₂SO₃后的光谱图。(图片来源：J. Am. Chem. Soc. )

MTT法测试探针结果表明探针（10 μM）对HeLa细胞无明显毒副作用。之后在紫外线照射不同时间条件下检测细胞活力，发现紫外线照射过程的光毒性低。然后作者在HeLa细胞中检测了Ly-NT-SP的细胞内光控方式。HeLa细胞在37 ℃下与Ly-NT-SP孵育20分钟，再用紫外光和可见光连续照射。Ly-NT-SP处理的HeLa细胞在绿色通道中显示出明显的绿色荧光。然而紫外线照射后，绿色通道的荧光消失，红色通道出现明显的红色发射，这是由于非活性Ly-NT-SP转化为SO₂活性的Ly-NT-MR的结果。然后，在可见光照射下，观察到绿色荧光明显增强，红色通道减少。这些结果清楚地验证了探针Ly-NT-SP对细胞内光致变色作用的光控策略。

 图3. 用Ly-NT-SP孵育细胞的共聚焦显微镜图像。(图片来源：J. Am. Chem. Soc. )

此外，作者还研究了探针Ly-NT-SP对活细胞中外源和内源SO₂检测的检测性能。用Ly-NT-SP预处理HeLa细胞15分钟，然后用紫外线照射2分钟。在红色通道中观察到强烈的红色荧光。外源SO₂（Na₂SO₃）加入后，绿色通道中的荧光信号随着红色通道中荧光信号的降低而显著增加。为了评价Ly-NT-SP对内源性SO₂的检测能力，用1 μg/mL脂多糖（LPS）预处理HeLa细胞，诱导细胞产生低水平的内源性亚硫酸盐。与用Ly-NT-SP处理和紫外光照射的细胞相比，脂多糖预处理的HeLa细胞显示出较强的绿色荧光，同时伴有相对较弱的红色荧光。综上所述，探针Ly-NT-SP能够同时跟踪活细胞中的外源和内源SO₂浓度变化。

 图4. 外源性Na₂SO₃和内源性Na₂SO₃（脂多糖预处理）对Ly-NT-MR的共聚焦显微镜成像。(图片来源：J. Am. Chem. Soc. )

接下来，作者测试了热休克情况下探针Ly-NT-SP 在HeLa细胞内对SO₂浓度变化的成像能力。HeLa细胞首先与Ly-NT-SP在37 ℃下孵育20分钟，然后用紫外光照射。之后再将细胞在37、39、41和43 ℃下进一步孵育30分钟，拍摄共焦显微镜图像。当温度升高时，红色荧光通道荧光信号明显降低，而在绿色通道中，观察到荧光增强。绿色与红色的发射比随着温度的升高而增加。而在细胞孵育SO₂抑制剂甲醛以后，发现绿色与红色荧光发射比值未发生明显变化。以上结果表明，热休克过程导致了溶酶体内SO₂浓度升高。此外，未孵育NAC组细胞与孵育NAC组细胞相比，绿色与红色荧光发射比值降低，可能的原因是NAC作为抗氧化剂抑制了细胞内SO₂的增加。

图5. 不同温度下，对HeLa细胞进行紫外照射后的共聚焦显微镜观察。(图片来源：J. Am. Chem. Soc. )

作者进一步研究了SO₂在热休克小鼠体内的抗氧化作用。将6-8周龄的雄性小鼠随机分为5个实验组，对照组、HS组、HS+NAC组、HS+HCHO组和HS+Na₂SO₃组。首先，在肠道组织中验证了紫外辐射将Ly-NT-SP转化为Ly-NT-MR的作用。与Ly-NT-SP孵育的回肠切片在红色通道中显示出轻微的红色发射。然后在暗室中用紫外线照射组织100秒，观察到红色通道中的红色荧光明显增强，绿色荧光同时减弱。这些结果表明，紫外光可以在组织水平将探针Ly-NT-SP转化为Ly-NT-MR。然后，HS组预处理回肠切片在37 ℃下与Ly-NT-SP孵育30分钟，并暴露在紫外线下3分钟，然后在37 ℃下再培养30分钟。与对照组相比，在HS处理的肠组织中，发现红色通道信号明显减少，绿色荧光信号增加。与对照组相比，HS处理小鼠的绿色和红色荧光比值增加了4.1倍。对于用Na₂SO₃处理的小鼠，获得的组织成像在绿色通道显示出显著的荧光增强，而红色通道的图像显示出很弱的荧光信号。此外，与对照组相比，注射Na₂SO₃引发的最明显的荧光比变化高达4.6倍。这些结果表明，热应激引起小鼠小肠SO₂的上调，这证实了Ly-NT-SP对SO₂精确成像的优势。除此之外，在Na₂SO₃和NAC预处理小鼠中观察到热应激引起的肠道损伤减少。这些结果表明，增加的SO₂可以通过抵御过量生成的ROS，在很大程度上减轻中暑引起的肠道损伤。

 图6. HS预处理肠道组织中SO₂的共聚焦显微镜图像。 (图片来源：J. Am. Chem. Soc. )

总结：山西大学阴彩霞课题组成功地开发了一种光激活型荧光探针，用于评估溶酶体中SO₂浓度的变化。Ly-NT-SP探针显示了良好的溶酶体靶向性，能够在紫外光照射下实现对SO₂进行精确检测。Ly-NT-SP也被成功地用于HeLa细胞中外源和内源SO₂的可视化成像。此外，Ly-NT-SP首次用于跟踪热休克期间溶酶体SO₂的变化。研究结果表明内源性增加的SO₂在调节细胞氧化应激中起重要作用，此外，增加的SO₂可保护小肠免受热应激引起的损伤。 

撰稿人：冯