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复旦大学黎占亭团队JACS：可以包合并传递蛋白质的水溶性柔性有机框架

来源：化学加（ID：tryingchem）      2020-03-18
导读：近日，复旦大学黎占亭教授、周伟副教授、张运昌团队以半刚性四阳离子四醛和四个柔性二酰肼为原料，合成了四种水溶性腙基三维柔性有机框架FOF-1-4。1H NMR谱图显示了重水中FOF-1-4的形成，动态光散射实验表明，这些多孔骨架的水动力直径在50-120 nm之间，随浓度的变化而变化。新的水溶性骨架具有较低的细胞毒性，并形成直径为5.3或6.7 nm的固有孔隙，使牛血清白蛋白、绿色和橙色荧光蛋白等蛋白质能够快速包合，并能有效地将蛋白质输送到正常细胞和癌细胞中，所输送的细胞百分率高达99.8 %。（DOI：10.1021/jacs.9b13263）
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多孔聚合物在分离、催化、包合和输送等方面具有巨大应用潜力，且三维聚合物由于其固有的网络化倾向，在结构上是多孔材料设计的理想材料。自20世纪40年代Flory开创性的理论研究以来，许多三维聚合物是由柔性单体制备的，具有固有纳米级孔的水溶性三维聚合物是DNA和蛋白质等生物大分子包合和传递的理想材料。然而，这类聚合物的设计和合成仍然是一个不发达的领域。动态共价化学为热力学控制的大分子和超分子靶的合成提供了坚实的基础。迄今为止，利用这一策略制备多孔聚合物的尝试主要集中在溶剂热条件下晶体共价有机骨架的构建上，具有纳米尺度孔的水溶性聚合物框架用于有效的客体封装尚未报告。作者通过平衡分子组分的刚性和柔性，在水中定量形成腙键，合成一种新的柔性有机框架，并证明这种新型水溶性框架具有良好的生物相容性，可以原位包裹蛋白质并进行有效的细胞内传递。
在水溶液中，肼和醛反应生成腙，作者利用多元原理将其定量化，制备了水溶性、半刚性的四醛T1和柔性的双酰肼L1-L4，并研究了它们的反应，制备了腙基三维聚合物。通过保持1:2的化学计量比，作者首次在重水中使用1H核磁共振波谱对反应进行了研究。在[T1]=2.4 mM时，反应在盐酸催化下在室温下定量进行，观察到在9.9 ppm下O=CH信号在约30分钟后完全消失。所有产物的1H核磁共振谱宽，暗示了氢化聚合物的形成。作者将这一新的聚合物家族称为柔性有机框架（FOF-1-4），因为它们是由柔性构建块通过动态的腙键合成的，并保持了固有的纳米级孔隙。将温度升高到90 °C导致FOF-1的1H NMR谱中出现弱CHO峰，这表明腙键部分水解。然而，当冷却到室温时，这个信号消失，这表明醛转变回腙。由T1和L1反应制备的FOF-1的1H NMR谱与通过稀释更浓的溶液获得的相同浓度溶液的1H NMR谱几乎相同，很好地反映了腙键的动力学特征。将浓度降低至0.6 mM不会产生任何CHO信号，表明在稀释溶液中腙键保持完整。进一步的1H NMR谱研究表明，在达到平衡后，对照化合物4-（4-苄基吡啶-4yl）苯甲醛（M1，9.6 mm）和L1（4.8 mm）的反应以88%的产率发生形成腙键。FOF-1-4的红外光谱表明，以1703 cm-1为中心的T1的醛C=O键的伸缩振动完全消失，与腙键的定量形成一致。
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图1. 水溶液中T1和L1-L4缩合反应合成腙基柔性有机骨架FOF-1-4。(图片来源：J. Am. Chem. Soc. )
FOF-1-4溶液的DLS曲线显示，在[T1]=2.4 mM时，溶液的水动力直径（DH）分别为122、91、122和106 nm。溶液静置3个月后得到类似的结果，这表明了均质框架的高稳定性。相比之下，T1在2.4 mM的溶液中DH值要小得多，约为10 nm，这反映了疏水性4-苯基吡啶单元的分子间堆积。骨架的DH值随浓度的降低而降低，然而即使在[T1]=0.1 mM时，溶液的DH仍在12到38 nm之间。为了研究pH值对骨架DH变化的影响，作者用NaOH将上述FOF-1溶液调节至pH=7.3，然后稀释至[T1]=0.1 mm。将稀释溶液静置24小时，然后进行DLS测量，测量的DH为91 nm。显然，在弱碱性介质中，动态聚合物中的腙键交换变得非常缓慢，这对于蛋白质的包封和传递至关重要。pH=7时，FOF-1-4的ζ电位分别为46.2、25.3、23.9和38.6 mV，这表明所有的框架表面都带正电。 
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图2. pH=4.5时25 °C水中不同浓度的FOF-1和T1的DLS。(图片来源：J. Am. Chem. Soc. )
分子模拟研究表明，T1的醛基不能与L1-L4缩合形成简单的1+1大环。通过假设理想的缩合过程和所有脂肪族链采用完全伸展构象，FOF-1-4将形成一个动态的三维菱形框架。通过两种组分的6+6缩合形成的环己烷样孔的孔径计算，FOF-1约为5.3 nm，FOF-2-4约为6.7 nm。为了测试这些动态共价聚合物是否形成固有孔，作者进行了客体包裹体研究。采用减压蒸发法制备了FOF-1和FOF-4粉末。干燥后将粉末置于宽度为2.3 nm的刚性4,4′,4″,4′″-卟啉-5,10,15,20-四苯甲酸盐（PTB，作为钠盐）溶液中，并使用紫外可见光谱跟踪客体吸附。向PTB水溶液（0.25 mM，3 mL）中加入两种粉末1.1、2.2、4.4或6.6 mg，通过记录吸附前后PTB的吸光度，我们确定61 %、71 %、88 %和100 %的PTB被FOF-1吸附，66 %、75 %、90 %和100 %的PTB被FOF-4吸附。这一事实支持了骨架不是仅仅吸附在表面，而是形成了包含卟啉客体的固有孔隙。
然后，作者使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）分析，用ana-1、hepg2、lovo和skov3细胞系评估FOF-1-4的细胞毒性。在30 μg的浓度下，所有16个被测细胞系的存活率均保持在85 %以上。在60 μg浓度下，15株细胞系仍保持75 %的存活率，其中1例存活率为71.5 %。这些初步结果表明，框架的细胞毒性相当低。
BSA、GFP和OFP这三种蛋白质均产生负的ζ电位，而它们与框架的混合物均表现出4.9-25.8 mV的正ζ电位。这些观察结果支持了框架和蛋白质之间的强相互作用，这种作用可能通过简单的表面到表面的接触或框架对蛋白质的包合而发生。由于共焦激光显微镜成像和流式细胞仪实验显示，该框架具有良好的细胞传递蛋白质的能力，因此有理由认为该蛋白质包含在框架内。三种蛋白质的溶液在没有和存在框架FOF-1和FOF-4的情况下表现出非常相似的圆二色性信号，这表明框架中包含的蛋白质保持其二级和三级结构。
在ana-1细胞系中追踪溶酶体，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核，研究FITC-BSA的传递。FITC-BSA和FOF-1-4孵育16h后，用共焦激光扫描显微镜对细胞进行观察。结果发现，四个样品的FITC标记荧光信号都非常清晰，用Lyso追踪溶酶体和DAPI染色细胞核的荧光信号高度重叠。在没有框架的情况下，没有观察到游离FITC-BSA的FITC标记的荧光。这些观察清楚地支持了所有四个框架都将BSA导入ana-1细胞。进一步的CLSM实验表明，这四个框架还可以实现GFP或OFP向ana-1细胞的传递。
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图3. 存在或不存在FOF-1-4时，用FITC-BSA孵育16 h后ana-1细胞的共焦激光显微图像。(图片来源：J. Am. Chem. Soc. )
进一步研究FOF-1-4向ana-1细胞内传递FITC-BSA、GFP和OFP的过程。对于FITC-BSA，四个框架都表现出良好的交付能力。转染细胞百分比（PTC）在75.0-92.2 %之间。如果没有框架，FITC-BSA自身的PTC为2.0 %。1:2的重量比代表了FITC-BSA框架的大量负载。当FOF-1的量减少到1:1的重量比时，仍然可以实现64.0 %的PTC。然而没有这些框架，两种蛋白都不能显著地转染细胞， PTC低至1.8 %或3.7 %。其中，FOF-1的运力最大。利用流式细胞术进一步评估FOF-1-4对FITC-BSA向skov3、hegp2和lovo癌细胞的转运能力。对于skov3细胞系，所有的骨架均表现出较高的传递效率，PTC为95.4-99.8 %。对于lovo细胞系，FOF-1、FOF2和FOF-4表现出良好的传递能力，PTC在83.7 %到93.0 %之间，而FOF-3 PTC=65.2 %。对于hepg2细胞系，框架的传递能力普遍降低。然而，FOF-1和FOF-4仍分别实现了84.4 %和82.3 %的PTC。
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图4.（a）FITC-BSA、GFP和OFP经C1或FOF-1-4（进入ana-1细胞系的递送实验，以及（b）FITC-BSA经C1或FOF-1-4在37℃下孵育16小时后进入skov3、hepg2和lovo癌细胞系的递送实验。(图片来源：J. Am. Chem. Soc. )
总结：在这项研究中，黎占亭团队证明可以通过从容易获得的阳离子和亲水性前体形成动态的腙键来制备具有纳米级孔的水溶性柔性有机框架。所得到的共价聚合物的固有孔隙率是通过引入刚性四苯甲烷载体实现的，而由四元单体诱导的多价性允许定量形成腙键，从而形成尺寸超过100 nm的多孔骨架。柔性聚合物框架的大孔既有离子结构域，也有疏水结构域，可包合不同的蛋白质，以实现高效的细胞内传递。柔性多孔有机框架是新兴晶体共价有机框架的独特扩展，其水溶性和稳定性好、纳米尺寸可控、易于制备等特点为其作为生物相容性软材料的应用打开了大门。

撰稿人：冯虹


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