对生物活性分子进行成像能够帮助我们理解其结构的多样性及其发挥生理活性的结构基础。在亚纳米分辨率下通过冷冻电镜技术对蛋白质进行成像已经为人们对蛋白质的理解提供了关键的结构信息。但与结构呈严格线性的蛋白质及核酸不同，寡糖与多糖中的单糖具有多个链接位点，且每个位点都存在α及β异构体。随着技术手段日新月异，离子迁移质谱与冷冻红外光谱技术极大地促进了寡糖及多糖的分析，但这些分析手段都是基于分子系综的平均态，无法对单个分子进行分析，而通过隧道扫描显微镜技术(scanning tunnelling microscopy, STM)可以实现对单一分子的精准成像，最近，德国马克思-普朗克固体研究所与马克思-普朗克胶体与界面研究所的K. Kern教授，P. H. Seeberger教授与S. Rauschenbach教授开创性地利用STM实现了对不同连接的直链与支链寡糖及多糖的精准成像，并对其连接与构象进行了分析，为糖组学及糖密码的研究奠定了坚实基础，相关成果发表在Nature（DOI: 10.1038/s41586-020-2362-1）上。

由于可靠的STM实验需要严格控制环境为超高真空(ultrahigh vacuum, UHV)以减少表面杂质的影响，因此，用于分析的糖苷样品需要通过电喷雾离子束沉积技术(ES-IBD)制备。将ES-IBD技术与STM技术结合以进行分子成像已被广泛应用于包括染料、多肽、蛋白以及二糖等多种非挥发物质的分析。气态的分子离子束糖苷随后在飞行时间质谱检测器监测下通过核质比分选器纯化以进行成像(Fig.1a)。该方法的显著优势在于其样品需求量少，仅需要数微克就可以完成样品的制备及分析。作者通过自动合成仪合成了一系列结构明确的寡糖及多糖，并在低能电子束(5 eV)下对其进行软沉积，该温和过程可以保证糖苷键不被破坏，随后通过分子碰撞，糖苷的构型得以实现重组分配。在本实验中，作者在低温条件下限制分子运动，得到了在界面上均匀分布的单一分子，因此，作者可以通过STM对分子进行进一步观察。

(图片来源：Nature)

作者首先对在还原端连有烷氨基linker的线性α-1,6-甘露五糖，α-1,6-甘露六糖以及β-1,6-葡萄六糖进行了分析(Fig.1b, e, h)。在STM成像图中，不同的糖苷在不同构象下具有相近的长度。低温条件下，分子热运动被消除，因此分子被固定在不同构象中。每个寡糖中的单糖单元以突起的形式被呈现：甘露五糖中包含5个特征突起而甘露和葡萄六糖中包含6个特征突起，突起高度在0.15 nm到0.25 nm之间变化，而且每个突起清晰地被分隔开。对所有1,6-连接的寡糖，单糖之间的距离为0.52 ± 0.07 nm，与糖的构型无关，烷氨基linker在图像中呈现为低突起。由于这些数值与二糖的STM图像相符，作者将这些数值用作进一步研究糖苷键的标准指数。

为验证STM图像是否能区分寡糖的连接方式，作者随后设计了支链甘露六糖4和5，其中，六糖4中R2和R3残基分别缀有两个单糖残基，而六糖5中仅在R2残基上缀有一个二糖残基。通过对其进行STM成像(Fig. 2)，作者发现STM图像清晰地展现出了分支结构，六糖4的STM图像中，两个支链分布在主链两侧呈接近90度分布，其中α-1,6糖苷键的长度为0.53 ± 0.05 nm，与此前观察一致，而α-1,2糖苷键明显增长，为0.61 ± 0.02 nm，这种长度差异使得六糖中的每个单元均能被识别，同时表明主链发生了轻微扭曲。而寡糖5形状更加紧凑，这是由于5具有更大的柔韧性，尽管软沉积可以排除污染，但含较长支链的结构更易发生折叠掩盖成像，在STM图像中，各个单分子图像中的突起数量明显减少，增加了分析难度。因此，作者仅选取了含正确突起数量的分子图像进行分析(Fig.2e)，在图像中，该分子构象充分伸展，可以清晰地辨别分支点，通过对烷氨基linker进行定位后，该分子中每个单糖残基均可被识别。

(图片来源：Nature)

该方法同样适用与具有更大聚合度多糖的精准成像(Fig.3)。具有三分支结构的十一糖的STM图像表明所有的分支彼此分离，而且多糖中的每一个单糖单元都是可见的，因此，多糖中的三个臂可以通过其包含的甘露糖残基数辨别。α-1,3和α-1,2糖苷键的长度不同，可用于区分D2和D3臂，进而可以确定壳寡糖分支。该分子高度较其他分子而言更高，可能是三个支链空间相互作用的结果。

(图片来源：Nature)

该方法的另一个优势在于可以使用ES-IBD技术从寡糖混合物中分选出含特定质量的寡糖(Fig.4)，比如，通过对核质比四级杆分选器进行调整可以实现甘露五糖和甘露六糖的准确分离，随后可以对两种寡糖分别进行成像分析。

(图片来源：Nature)

总结：德国马克思-普朗克固体研究所的K. Kern教授、S. Rauschenbach教授与马克思-普朗克胶体与界面研究所的P. H. Seeberger教授共同合作利用STM对多种寡糖及多糖进行了成像分析，为研究聚糖的拓扑，结构和功能提供了化学选择性的方法。在低温条件下以亚纳米级分辨率以可视化手段研究固定构象的单一糖苷分子，可防止由于构象平均化而导致的信息丢失。经过质量分选确保观察到的几何形状和拓扑结构可以明确地与结构特征相关。在单分子水平上化学选择地获得寡糖的结构信息将为进一步认识糖类化合物的结构奠定基础，在破译糖代码的道路上迈出坚实的一步。

撰稿人：H.D.