第二个近红外窗口（NIR-II，1000-1700 nm）中的荧光团由于比第一个近红外窗口（NIR-I，650-900 nm）具有更好的成像质量和更深的组织穿透力而受到广泛关注。目前，NIR-II荧光团主要以无机纳米材料为基础，但其有争议的毒性阻碍了其临床前的转化。相比之下，有机小分子染料，如亚甲基蓝和吲哚青绿（ICG），已呈现出令人满意的安全性，并已在临床上使用多年。因此，有机荧光团是体内成像的首选。到目前为止，NIR-II型有机小分子荧光团主要有两种类型。一种是聚甲基，但其斯托克斯位移有限，化学稳定性差。另一类荧光团具有给体-受体-给体（D-A-D）特性，一个典型的例子是苯并[1,2-c:4,5-c′]双( [1,2,5]噻二唑)（BBTD）衍生物。与聚甲基硅氧烷相比，D-A-D荧光团在体内表现出更大的斯托克斯位移（>200 nm）和更高的信号背景比成像。但是现有的基于BBTD的荧光团在体成像的最大吸收波长和发射波长分别在800和1000 nm左右，仍然比较短。因此，开发具有更长波长的新型荧光团是非常需要的，这实际上是光谱探针领域最重要的前沿课题之一。

为此，作者研究了目前构建基于BBTD的NIR-II荧光团的方法，发现在BBTD骨架中用硒取代硫原子可以增加分析波长；另一方面，引入给电子氨基也可以延长波长。然而，这些措施只会导致波长红移≤50 nm，如何进一步增加波长仍然是一个挑战。在本研究中，作者同时在BBTD骨架中引入一个硒原子和一个氨基，设想这样的结合会导致波长的大幅增加。通过这种设计，作者研制了一种新型的有机小分子荧光团FM1210，其最大发射波长为1210 nm，并与硫取代类似物CF1065的光谱特性和图像质量进行了比较。值得注意的是，FM1210在发射波长上显示出145 nm的大红移，量子产率和亮度相当；这个波长增益大约是BBTD衍生物单次修饰所获得的（∼50 nm）的3倍。超过1200 nm的波长大幅增加可归因于硒原子和氨基的协同作用，从而使使用FM1210的活体成像质量比CF1065高得多。这些优点进一步使NIR-II荧光成像能够以100 fps的速度对整个小鼠身体进行。此外，作者还证明了纳米级的FM1210脂质体（FM1210-NPs）可以应用于肿瘤及其血管系统的高信号背景比的活体成像。

图1.近红外荧光团FM1210和CF1065的结构（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

比较了FM1210与CF1065的吸收光谱和荧光光谱。FM1210在CH₂Cl₂中在980 nm处显示一个强吸收峰，在1210 nm处显示一个荧光峰（量子产率0.036%）。相比之下，CF1065的吸收峰和荧光峰分别出现在855 nm和1065 nm处，量子产率为0.041%。FM1210的大红移可能是由于重原子和引入的氨基在调节能隙方面的协同作用。为了深入了解结构与波长之间的关系，作者研究了四种不同结构的类似物的光谱性质，发现FM1210中硒原子和氨基同时存在有利于大波长红移。这与对能隙的理论计算是一致的。

图2. FM1210和CF1065在不同溶剂中的吸收光谱以及FM1210和CF1065在980和808 nm激发下的荧光光谱（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

另一方面，FM1210和CF1065在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中表现出微弱的荧光（量子产率<0.01%）。然而，将这些染料添加到含有白蛋白的胎牛血清（fbs）或pbs中会产生显著的荧光，这可能是由于染料-蛋白质复合物的形成。此外，fm1210和cf1065在fbs中是稳定的。以上结果表明染料可能有利于血管成像。还发现，fbs和白蛋白可引起cf1065和fm1210的最大发射波长发生蓝移。< span="">

FM1210优越的光谱特性，低细胞毒性和无明显器官损伤，启发作者探索其在活体荧光成像中的应用。首先，对同一只BALB/c裸鼠在808 nm和980 nm激发下的自身荧光进行了测定。在相同的激发功率和曝光时间（ET）下，980 nm下的自荧光明显弱于808 nm下的自荧光，说明较长的波长可以有效地降低自荧光。

静脉注射FM1210或CF1065后，可观察到明显的血管荧光。仔细检查发现，FM1210的血管显示出比CF1065更高的分辨率；放大后的腹部血管图像更清晰。放大后的股骨血管图像也显示出FM1210的对比度有所改善。此外，从股骨血管横截面线的荧光强度分析显示有四条血管存在。结果表明，FM1210可显著提高活体成像的信号背景比。进一步研究了FM1210在小鼠血液循环和尿液排泄中的荧光动力学。FM1210在血液循环和尿液排泄中的半衰期分别为4.6±0.2 h和1.6±0.2 h。

图3.携带FM1210和CF1065的BALB/c裸鼠的代表性NIR-II荧光图像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

由于体内穿透深度有限，用NIR-I染料很难获得高质量的视频。在这里，作者使用FM1210，对一只麻醉老鼠的全身进行高速成像。即使分辨率为640×512像素，作者也可以以100 fps的速度获得清晰的NIR-II视频，这可能是NIR-II成像速率最高的。通过这段视频，作者测量到每分钟234次心跳。值得注意的是，心房搏动和心室搏动之间约0.12秒的细微延迟可以通过高速成像得到解决。作者还用同样的方法对处于非麻醉状态的老鼠进行了成像，并测量到每分钟大约420次的心率。因此，FM1210可能为心脏研究提供一种有前途的方法。

图4.高速成像麻醉小鼠静脉注射FM1210（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

肿瘤成像迫切需要具有被动靶向能力、良好水溶性和生物相容性的荧光纳米粒子。因此进一步将FM1210包封于脂质体中，得到纳米级的FM1210（FM1210-NPs），其含量为2.6±1.2%（w/w），粒径为20-22 nm。在PBS中，FM1210-NPs比FM1210具有更强的荧光。重要的是，FM1210纳米颗粒显示出至少24小时的高稳定性、低细胞毒性和更好的水溶性。FM1210-NPs在血液循环和尿液排泄中的半衰期分别为5.7±0.4 h和2.3±0.3 h，表明其体内滞留时间比FM1210长。荷瘤小鼠尾静脉注射FM1210-NPs后，肿瘤血管结构丰富而精细，其中扩张的血管和毛细血管易于区分。肿瘤内的荧光强度随着时间的推移先增加后降低，这是由于FM1210-NPs在体内的动态变化所致。且FM1210-NPs在肿瘤内有蓄积的趋势，肿瘤与正常组织的荧光比值最高出现在4 h，另外，24 h后，体外生物分布证实FM1210-NPS在肿瘤区域有效富集，这可能是被动靶向所致纳米颗粒的能力。另一方面，用FM1210进行了等效研究，发现荧光信号并不集中在肿瘤区域。这些观察结果表明纳米级的FM1210纳米颗粒可能对肿瘤研究有用。

图5.FM1210-NPs的肿瘤荧光成像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结：总之，目前用于体内成像的小分子荧光团在1100 nm处荧光发射最大，而中国科学院化学研究所马会民、史文课题组的新FM1210在1210 nm处荧光发射最大。与CF1065相比，FM1210的波长增加了145 nm更是一个很大的进步，这主要是由于硒原子和氨基的结合。且FM1210比CF1065显示更低的背景，更好的分辨率和更高的信号背景比。使用FM1210，作者已经实现了100帧每秒的高速NIR-II成像。此外，FM1210-NPs还能成像肿瘤甚至其血管系统。总的来说，在体内成像中，FM1210比之前的小分子染料表现出了优势。

撰稿人：冯虹