在自然界中，许多蛋白质组装成特定的寡聚结构，其中包含多个不同蛋白质的精确数量和寡聚序列。这种组装可以决定蛋白质的生物学特性（例如，人IgM抗体包含五个蛋白质亚基）、催化特性（例如，真核RNA聚合酶II包含十二个蛋白质亚单位）、光物理特性（例如，蓝藻光系统I包含十二个蛋白亚基）、和膜转运特性（例如，青链霉菌钾通道包含四个蛋白质亚单元）。为了模仿并可能超越这些特性，需要对不同的蛋白质寡聚体进行模块化合成。尽管使用分子生物学技术（包括基因工程和突变蛋白质的重组表达）可以实现制备（Fig. 1A）。然而，通过重组表达制备许多蛋白质具有挑战性（例如，具有翻译后修饰的蛋白质、具有二硫键的蛋白质、毒蛋白质、或聚集的蛋白质），这可能限制了通过这些方法可以寡聚的蛋白质的范围。此外，化学方法是另一种控制寡聚的强大方法，如在基于特定位点进行非天然氨基酸的融合表达和附着在化学支架上进行组装（Fig. 1B）。然而，前者如果没有广泛的化学设计、蛋白质氨基酸序列的修饰和/或重组蛋白表达，获得大于二聚体或三聚体的单分散和序列编码低聚物是一项挑战。而后者必须改变DNA设计，以合成含有不同数量或寡聚序列的蛋白质寡聚体，这些限制大大阻碍了蛋白质寡聚体的构建和后续研究。

为了解决上述限制，作者提出了一组特定的DNA链可以用作模块化支架，将蛋白质组织成具有精确化学计量和寡聚序列的寡聚体（Fig. 1C）。这种DNA设计将使不同的蛋白质精确地组织成一系列单分散、序列编码的低聚物（Fig. 1Ci）。

Fig. 1: 蛋白质低聚技术及其局限性 （图片来源：Chem）

为了验证上述想法，作者选择三种通常用作检查点抑制剂的市售IgG抗体（即抗小鼠PD-1[A]、抗小鼠TIGIT[B]和抗小鼠CTLA-4[C]），使用模块化DNA支架进行蛋白质的序列编码寡聚。为了将单个DNA链安装到A、B或C上，将每个抗体与2当量含有N-羟基琥珀酰亚胺活化酯和叠氮化物（NHS–PEG12–N3）的低聚（乙二醇）分子反应45分钟（Fig. 2A）。在通过尺寸排阻色谱（SEC）纯化后，每个抗体表面上的叠氮化物与5当量含有二苯并环辛炔（DBCO）和荧光团的DNA链和两个不同的20碱基核酸序列进行叠氮化合物-炔环加成（SPAAC）反应。16小时后，约25%-30%的抗体被一条DNA链修饰。接下来，使用SEC从反应混合物中去除未反应的DNA。使用阴离子交换色谱法从未反应的抗体和用多条DNA链官能化的抗体中分离出用单条DNA链功能化的抗体（Fig. 2A）。之后，制备了三种不同的蛋白质DNA缀合物（即S2–A–Cy3–S3、S4–B–Cy5–S5和S6–C–FITC–S1），并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，Fig. 2B）和SEC确认其含有单一DNA功能化。

Fig. 2: 单链DNA的抗体功能化 （图片来源：Chem）

通过将纯化的蛋白质DNA缀合物（Fig. 3A和3E：lane 1-3）与模板DNA链混合来合成蛋白质低聚物。等量的B-DNA缀合物、C-DNA缀合物、S50-60模板链、S50-S60模板链，混合S10-S20模板链以合成具有寡聚序列S4-B-C-S20的蛋白质二聚体（Fig. 3B），组装产率为68%。由于不存在与S4或S20 DNA序列互补的DNA序列，因此在组装混合物中未观察到含有多于两个抗体的低聚物。使用SEC纯化从组装混合物中的未反应单体和模板链中分离蛋白质二聚体，并用琼脂糖凝胶电泳进行表征（Fig. 3E: lane 4）。琼脂糖凝胶显示二聚体的单一条带，仅具有预期的Cy5和FITC荧光，电泳迁移率低于单独的抗体-DNA偶联物。结果表明，成功合成了具有寡聚序列S4-B-C-S20的单分散和序列编码的蛋白质二聚体。

Fig. 3: 利用DNA-DNA相互作用将抗体寡聚成编码序列 （图片来源：Chem）

接下来，作者将等量的A-DNA缀合物、B-DNA缀合物、C-DNA缀合物、S30-S40模板链和S50-S60模板链混合，以27%的组装产率合成具有寡聚序列S2-A-B-C-S1的蛋白质三聚体并通过琼脂糖凝胶电泳对其进行表征（Fig. 3C，3E: lane 5）。此外，作者使用抗原结合和检查点抑制剂活性细胞测定法研究了用DNA功能化和用模块化DNA支架寡聚后人抗体的靶向结合特性。结果表明，每个样品中保留了抗原结合和检查点抑制剂活性。

最后，作者使用蛋白质二聚体和三聚体作为构建模块成功合成了具有寡聚序列S4–B–C–A–B–C–S1的单分散和序列编码的蛋白质五聚体，其中三种不同的抗体被组织成精确的低聚物序列（Fig. 3D，3E: lane 6）。这是第一个报道的单分散抗体五聚体，其包含预定义寡聚序列中的不同抗体。

总结：

Chad A. Mirkin院士团队展示了如何使用可推广的生物偶联化学和精心设计的DNA支架合成单分散、序列编码的蛋白质低聚物。因为这种通用的蛋白质低聚方法可以合成具有不同化学计量和低聚物序列的低聚物，而无需重新设计蛋白质或DNA支架，表现出了其强大性和实用。更为重要的是，这一合成进展将使后续研究和理解蛋白质低聚物结构和性质之间的基本关系成为可能，这对许多领域（如治疗学、催化、光合作用和膜运输）具有重大意义。