荧光纳米显微成像技术由于非侵入性、特异性强、分辨率高（纳米级）等特点，被广泛用来观察生物样品的精细结构。化学特异性荧光探针和“开-关”型荧光探针则为该技术的核心。光激活染料和笼状染料在光的诱导下就可以发生可逆的荧光“开-关”转换，省去了特定的成像缓冲溶液以及高强度的紫外激发光，因而被广泛应用于单分子成像显微镜当中，如光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重构显微镜（STORM）。罗丹明染料因具有性能可调、细胞膜通透性好、亮度高和光稳定性好的优点而备受青睐。然而，已报道得的罗丹明的“笼闭”策略是依赖于“锁住”染料分子使其不发光。一种是在氮原子上引入“光不稳定的保护基团”，另外一种是将内酯环转化为相应的环状α-重氮酮。前者会限制分子的取代方式，造成化合物水溶性变差、潜在的光毒性的问题，而后者会面临非荧光副产物的形成以及潜在有毒副产物等问题。因此，发展无“笼闭”基团、光激活效率高以及生物相容性好的荧光团用于荧光显微镜和纳米显微镜具有重要意义。本文中，作者合成了一系列功能化的氧杂蒽酮化合物，在单光子或者双光子激发下，分子会高效地转化为相应的二氢吡喃环派若宁染料。PaX染料通过三步合成即可被简易制备，该策略可扩展到碳和硅桥联的氧杂蒽酮类似物，得到一系列跨越大部分可见光谱的光激活荧光标签。其中，PaX衍生物硅-派若宁染料展现了良好的生物相容性和优异的光稳定性。最后，作者还成功地将PaX染料用于传统光学显微镜和超分辨显微镜的细胞成像当中。

作者利用光化学反应去组装或者“锁住”荧光团而不是“解锁”光不稳定的保护基团”的策略制备得到了新型笼状的罗丹明染料（Figure 1a）。通过在氧杂蒽酮骨架上引入合适的分子内自由基捕获基团，二芳基酮和自由基捕获基团（苯乙烯）通过光触发级联途径可以光组装为9-烷氧派若宁荧光团（Figure 1b）。为了研究自由基受体的取代作用，作者进一步合成了一系列光激活硅-派若宁染料（Figure 1c）。其中，化合物1-6在400 nm处具有较强的吸收峰。在光激活下，化合物1-6在质子溶剂中（如100 mM, pH=7的磷酸盐缓冲溶液）会经历快速且完全的化学结构变化，表现为明亮的发射（Figure 1d）。经实验测得，乙烯基取代的化合物1的光激活速率最慢，随着烯烃取代基团的增加，化合物4的速率最高，这可能是因为α-甲基取代基对烯烃的诱导作用（Figure 1e）。此外，作者还对进一步修饰的PaX染料化合物9-12进行了光激活速率的测试，化合物11的速率较高（Figure 1f），并得到其在一系列生理环境pH值下的光激活速率（Figure 1g）。最后，作者还测试了化合物11的光学稳定性，性能要优于商用染料（Figure 1h）。

Figure 1.  PaX染料的设计合成及表征（图片来源：Nat. Chem.）

接下来作者探究了上述化合物在生物成像中的应用（Figure 2）。通过在PaX₅₆₀分子上偶联具有氨基反应活性的N-羟基丁二酰亚胺基团，可将其用于靶向色氨酸上的-NH₂基团，因此得到了PaX₂₆₀-NHS探针。并分别进行了STED和PALM超分辨成像。同时，在PaX₅₆₀分子上偶联具有巯基反应活性的马来酰亚胺基团，得到的PaX₄₈₀, PaX₅₂₅ 和PaX₊₅₆₀探针可用于靶向色氨酸中的-SH基团。对于固定细胞肌动蛋白的标记，在PaX₅₆₀分子上偶联鬼笔环肽（phalloidin），制备的PaX₂₆₀-phalloidin探针可实现对细胞的STED和PALM超分辨成像。

Figure 2. 光激活染料用于光学成像（图片来源：Nat. Chem.）

为了评估PaX染料用于活细胞成像的光激发机制，作者制备了分别带有线粒体和溶酶体靶向基团的染料PaX₅₆₀-Mito和PaX₅₆₀-Lyso（Figure 3a和b）。数据表明，在较高和较低的pH值条件下，两种染料都具有良好的细胞器靶向性和光激活特性。同时，作者还制备了Halo Tag特异性的氯烷烃衍生物（PaX₅₆₀-Halo）和SNAP特异性的O⁶ -苄基鸟嘌呤衍生物（PaX₅₆₀-SNAP），并得到了PaX₅₆₀-Halo 标记的U2OS细胞中波形蛋白的双光子共聚焦图像以及STED图像（Figure 3c-f）。

此外，在405 nm激光的照射下，PaX₅₆₀-Halo 和AL-560探针可实现在单个激发/检测通道下对U2OS细胞中的微管蛋白和波形蛋白的共聚焦多色成像（Figure 4a-e）。

Figure 3. 光激活PaX染料用于活细胞成像（图片来源：Nat. Chem.）

Figure 4.  PaX染料用于双通道成像（图片来源：Nat. Chem.）

另外，作者将化合物21和22用于活细胞SMLM成像当中（Figure 5）。所得到的图像均可显示明显的蛋白形貌，说明PaX染料可以进行有效的细胞标记和检测。最后，作者还将偶联抗体的化合物14成功用于对HeLa-Kyoto细胞的MINFLUX成像当中（Figure 6），平均标记精度可以达到3.7 nm。

Figure 5. 自标记PaX₅₆₀底物对活细胞的PALM成像（图片来源：Nat. Chem.）

Figure 6.  PaX₅₆₀底物对细胞的MINFLUX成像（图片来源：Nat. Chem.）