图1. 光酶催化不对称XEC反应（图片来源：Nature）

催化交叉偶联形成Csp²–Csp²键已彻底改变了有机合成，在制药和农化行业都具有广泛应用。随着目标分子结构越来越复杂，特别是结构中含有大量sp³杂化的原子和手性中心时，就需要发展高立体选择性的策略来构筑Csp³–Csp³键。两个完全不同的Csp³-亲电试剂偶联可在一定程度上替代传统的交叉偶联，因为该方法具有更好的官能团容忍性，且不需要使用敏感的有机金属试剂。然而，由于金属催化剂很难区分两个不同的Csp³-亲电试剂，这些反应的选择性并不好，通常得到自偶联产物。在此之前，催化不对称Csp²–Csp³交叉偶联已经取得不错的结果，但不对称Csp³–Csp³交叉亲电偶联却尚未突破（图1a）。

利用生物催化反应具有高选择性这一特点，作者考虑是否存在一种酶可以催化不对称Csp³–Csp³交叉偶联，探索以前不被重视的机理和催化策略。作者根据硝基烷烃的反应性，设想了一种机理：首先卤代烷烃被还原形成烷基自由基4，它可以与原位生成的中间体5反应形成新的C–C键和硝基自由基负离子6。随后酶介导的C–N键裂解产生亚硝酸盐和一个烷基自由基7，最后通过氢原子转移（HAT）终止，得到交叉偶联产物3（图1b）。

上述设想最大的挑战在于如何精确控制电子转移过程的化学选择性。最近，包括本文作者在内的多个课题组证明了黄素依赖‘烯’还原酶（EREDs）可以利用蛋白质模板电荷转移（CT）配合物还原卤代烷。如果蛋白质只与卤代烷形成CT络合物，则会在硝基烷烃上选择性还原。最后，EREDs可以精确控制自由基终止步骤HAT的立体化学，使产物具有优异的对映选择性。

首先，作者使用α-氯代酰胺1a及1-硝基乙基苯2a作为模板底物，在青色光（λ_max = 497 nm）的激发下，很多‘烯’还原酶都可以顺利催化该反应，得到亲电交叉偶联产物3a。如图1c所示，来源于惰性柄杆菌的‘烯’还原酶CsER展现出优异的立体选择性控制，以28%的收率和95:5 er得到产物(S)-3a，继续调节反应体系的pH，反应收率可提高到92%，对映选择性保持不变。有趣的是，源自于氧化葡糖杆菌的还原酶变体GluER-T36A有利于得到对映体(R)-3a（51%收率，10:90 er）。控制实验表明，ERED、青色光和NADPH（还原型辅酶Ⅱ）的循环再生（GDH/NADP⁺/glucose）均是实现优异反应性的关键。值得注意的是，使用其他的光氧化还原催化剂时并不能得到产物3a，当Ir(ppy)₃作为催化剂时，只检测到硝基烷烃2a被还原成肟，该结果也证明了生物催化独特的反应性。

图2. 底物适用范围（图片来源：Nature）

基于上述最优反应条件，作者对该体系的底物适用范围进行了考察（图2）。对于α-芳基硝基乙烷，芳基间位或对位含有供/吸电子基团都能以优异的结果转化为目标产物9-16。芳基邻位有取代基时反应结果较差（8），位阻较大的α-萘基硝基乙烷也可在体系中兼容（17）。然而，这种酶局限于α-位上相对较小的烷基取代基，只有α-位为甲基或乙基时才能取得不错的结果（18-21）。另外，这种酶催化体系可以兼容含有各种杂环的硝基烷烃类底物（22-24），以及α-硝基丙酸乙酯（25）。

对于α-卤代乙酰胺底物而言，氮原子上取代基的结构对反应的结果影响很大，含有甲基或苄基的二级酰胺底物以不错的对映选择性得到产物26和27。含有四氢吡咯、哌啶或吗啉等骨架的三级酰胺，以及线性Weinreb酰胺以中等到优异的收率和对映选择性得到目标产物（28-33）。另外，该体系对α-卤代酯和α-卤代酮也能不错的兼容（34-37）。

图3. 产物衍生化（图片来源：Nature）

作者也尝试对XEC产物进行衍生转化，如图3所示，β-手性酰胺3a可以顺利地还原成三级胺41，产物16也能顺利地水解成酸（42）并进一步还原成醇（43），对映选择性均可以保持。

图4. 反应机理研究（图片来源：Nature）

最后，作者对反应机理进行详细的研究，包括UV-Vis光谱实验，控制实验和DFT计算（图4）。首先，UV-Vis光谱实验表明α-氯代酰胺1a与FMN_hq之间形成CT复合物，而在可见光照射下硝基烷烃2a与CsER和辅助因子的实验结果表明初始阶段硝基烷基还原是可以发生的。如图4a所示，将硝基中间体5的类似物硝酮38加入到1a和还原的CsER体系时，UV-Vis光谱表明CT复合物的信号进一步增强，表明反应过程中形成了四元CT复合物，能够有效促进自由基的形成和自由基间的加成。在标准条件下，当α-硝基甲苯2l与1a反应时，可以得到交叉偶联的目标产物18（28%）和硝基化合物40（29%），然而将产物40再次置于标准条件下，并没有检测到产物18，由此可推断化合物40不是偶联产物18的中间体（图4b），进一步研究发现该反应条件下脱硝过程和电子转移到FMN_sq之间存在竞争。作者也对标准反应进行了DFT计算，图4c结果表明初始的α-酰胺自由基int-1与中间体5快速加成形成自由基负离子中间体int-2，随后它经历一个不可逆的脱硝基过程得到中间体Int-3，最后通过HAT过程被FMN_sq淬灭得到产物3a，这一过程也被氘代实验证实。另外，硝基甲苯2l的DFT计算研究表明，与2a参与的模型反应相比，初始加成和脱硝基过程的能垒均高于模型反应，此结果也说明脱硝基过程较慢，并且自由基负离子Int-2'可以被FMN_sq氧化终止，最终得到产物40。