多取代的6元环骨架是药物分子和活性天然产物中常见的结构单元。近年来，对于手性环己烷的合成研究受到学术界和制药工业界的广泛关注。狄尔斯-阿尔德反应（Diels-Alder reaction，简称D-A反应）即共轭双烯（二烯体）与取代烯烃（亲二烯体）之间发生的[4+2]环加成反应，是合成化学中构建六元环骨架最常用的方法之一，已经在天然产物全合成中得到了广泛运用。但传统的不对称D-A反应在立体选择性以及反应模块性方面存在明显的不足，这极大的限制了其在药物合成上的应用。鉴于酶催化往往具有高效、绿色的特点，近年来对于D-A反应酶的挖掘和工程化改造受到广泛关注。北京大学化学与分子工程学院雷晓光课题组在此前的工作中，从桑树中发现了首例催化分子间endo 或exo选择性D-A反应的酶（MaDAs），并对其催化机理，底物范围进行了深入研究，为进一步对该家族的酶工程改造奠定了基础（Gao et al, Nat. Chem., 2020, 12, 620；Gao et al, Nat. Catal., 2021, 4, 1059）。2022年11月16日，雷晓光课题组在在Cell Press细胞出版社期刊Chem Catalysis 上报道了针对D-A酶MaDA1的蛋白工程改造，并通过将酶催化的D-A反应与金属催化脱羧官能团化反应巧妙结合，利用生物催化与化学催化相辅相成和优势互补的特点，实现了环己烯骨架的多样性导向、精准合成。该研究工作为结构多样的六元环骨架的合成提供了新的思路，拓展了酶催化的应用范围。本研究巧妙地设计了亲双烯体1a，在与天然底物具有一定相似性的同时引入供后期脱羧官能团化的羧基前体酯基，以实现酶催化的D-A反应之后对产物进一步的多样性衍生。经过酶催化活性筛选，作者发现D-A酶MaDA1能够实现所设计的D-A反应，但反应收率、选择性需要进一步优化（43%， 93 ee%， 192 TTN， endo/exo = 4/1），对于MADA1的工程化改造势在必行。作者采用聚焦理性迭代位点特异性突变的策略（focused rational iterative site-specific，mutagenesis, FRISM），以极小的突变成本便获得了最佳突变体。首先利用丙氨酸筛选，对MaDA1口袋29个位点进行突变，确定了五个突变热点。考虑到丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、丝氨酸（S）、苯丙氨酸（F）等四种氨基酸在具有不同大小的同时，能够诱导底物与酶形成不同的相互作用，故以这四种氨基酸对选定热点进行突变。经过了三轮的突变和反应条件的优化，最佳突变体MaDA1-M3的催化效率提高了34倍，ee 值提高到>99%，产率提高到93%，TTN提高了14倍（如图1）。
为了进一步拓展最佳突变体MaDA1-M3的应用范围，作者系统探索了MaDa1-M3的底物范围，其对多种亲双烯体和双烯体的D-A反应展现出优异的活性和立体选择性，实现了一系列环己烯骨架的高效精准合成，如图2所示。
进一步通过将D-A产物进行全局性的酚羟基保护、苄基脱除、羧基活化，得到了脱羧官能团化的前体。该前体可用于多种不同的金属催化脱羧官能团化反应（如脱羧烯基化、脱羧炔基化、脱羧芳基化、脱羧烷基化、脱羧氢化、脱羧Giese反应、Curtius重排等），从而进一步转化为结构多样的环己烯骨架（如图3）。通过将生物催化的高立体选择性与过渡金属催化的适应底物多样性有机结合，快速、高效构建结构多样的化合物库，为环己烯类型化合物的药物筛选和开发奠定了基础。
图3. 酶催化D-A反应串联金属催化脱羧官能化反应综上所述，雷晓光课题组首次利用丙氨酸筛选与聚焦理性迭代位点特异性突变（FRISM）相结合的方式，实现了对D-A酶的蛋白工程改造，提升了酶催化活性和底物适用性。通过将酶催化的分子间D-A反应与多种过渡金属催化的脱羧官能团化反应相结合，成功实现了结构多样的手性环己烷骨架的构建。该工作为多取代手性环己烷骨架的高效合成提供了新的方法。在该研究中，雷晓光课题组北京大学“博雅博士后”王进博士为第一作者，雷晓光教授以及雷晓光课题组特聘副研究员高磊博士为共同通讯作者。雷晓光课题组的博士研究生杨军、郭念昕和丁琪在蛋白表达方面提供了帮助；博士研究生柯瀚、汤汝尧和本科生胡康德龙在底物合成和消旋体产物合成上提供了帮助。该工作得到国家自然科学基金，国家科技部重点研究发展计划，北京市“卓越青年科学家计划”，北京分子科学国家研究中心，北大-清华生命科学联合中心等多个国家重大科研项目和研究机构的资助。雷晓光课题组所开展的化学酶法合成研究工作也得到了瑞士诺华制药公司的资助。Diversity-oriented synthesis of cyclohexenes by combining enzymatic intermolecular Diels-Alder reactions and decarboxylative functionalizationsJin Wang, Han Ke, Jun Yang, Nianxin Guo, Kangdelong Hu, Ruyao Tang, Qi Ding, Lei Gao, Xiaoguang LeiChem Catal., 2022, DOI: 10.1016/j.checat.2022.10.027
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