细胞-细胞相互作用是生命过程中最基本的信息传递方式之一，在免疫应答、组织发育和神经传导过程中发挥重要作用，了解细胞间相互作用对于理解免疫过程的生物学基础和疾病发病机制及发展细胞免疫疗法都具有重要意义。

目前，研究人员已经开发了许多用于研究细胞-细胞相互作用的工具。包括显微镜成像技术、基于邻近效应的化学标记策略、用于检测细胞间相互作用的机械力拉伸策略、以功能为导向的对细胞间相互作用进行探索的手段以及单细胞基因表达为基础的预测分析方法等。开发这些技术的目的是为了解决一些关键的生物学问题，如：细胞-细胞相互作用发生在哪些位置？相互作用的空间和组织结构是怎样的？哪些细胞能够发生相互作用？有哪些生物大分子介导细胞间相互作用？如何通过操控这些生物大分子来调控细胞间的相互作用等。

近年来，通过邻近标记效应为基础的化学标记策略捕获细胞-细胞相互作用是化学生物学的研究热点，该策略已经被证明是研究细胞间相互作用的强有力工具，其主要过程是将酶或小分子催化剂装载到一种细胞上，这种细胞通常被称之为诱饵细胞，在酶或小分子催化剂催化下激活溶液中连有生物素的底物，将其标记到与诱饵细胞相互作用的细胞上，进而对细胞-细胞相互作用进行捕获（图1）。由于该策略可以通过链霉亲和素对生物素信号进行亲和富集，再通过质谱、凝胶成像、显微镜、流式细胞仪或基因测序进行检测和下游分析，能够极大程度实现我们研究细胞间相互作用想要解决关键生物学问题的目的，所以开发更有效的研究细胞间相互作用的邻近标记工具十分必要。

图1 邻近标记工具捕获细胞间相互作用流程及应用

近年来，南京大学化学化工学院李劼团队和合作者一起利用酶和小分子催化剂设计构建了多种用于研究细胞间相互作用的邻近标记工具（Cell, 2020, 183, 1117；J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 5517）。为了进一步满足免疫学和医学中的不同应用场景，他们基于之前用于研究DC-T细胞间相互作用的FucoID技术，利用岩藻糖转移酶（FT）的定点化学偶联发展了细胞-酶偶联体探针（Cell-sFT）和抗体-酶偶联体探针（Ab-sFT）。当有其它细胞与诱饵细胞相互作用时，FT可以将鸟苷二磷酸岩藻糖生物素（GDP-Fucose-Biotin）的底物标记到与诱饵细胞相互作用的细胞上的N-乙酰-D-乳糖胺（LacNAc）上，进而对细胞间相互作用实现捕获。另外，他们还利用过渡金属钌配合物Ru(bpy)₃²⁺开发了光控的Ru-¹O₂-hydrazide系统用于捕获细胞-细胞相互作用，通过生物正交反应分别将Ru(bpy)₃²⁺与1，2-双（二苯膦）乙烷（DPPE）、抗体（Herceptin）和鸟苷二磷酸岩藻糖（GDP-Fucose）偶联在一起，合成了三种Ru(bpy)₃²⁺衍生物：Ru-L、Ru-G和Ru-H，成功实现将Ru(bpy)₃²⁺装载到诱饵细胞表面的脂质、蛋白质和糖分子上，在450 nm光照和底物生物素酰肼（Biotin-hydrazide）存在下通过单线态机理对细胞间相互作用实现捕获（图2）。

图2 邻近标记工具箱中所含的探针、装载和作用机理

Cell-sFT、Ab-sFT、Ru-L、Ru-G和Ru-H这些探针共同组成了研究细胞-细胞相互作用的邻近标记工具箱，利用这些探针他们将酶或小分子催化剂分别装载到了鼠的树突细胞、癌细胞和OT-I T细胞、人的CAR-T细胞和癌细胞上，对由肽主要组织相容复合物-T细胞受体（pMHC-TCR）所介导的树突细胞-T细胞、癌细胞-T细胞和T细胞-树突细胞间的相互作用、由嵌合抗原受体-抗原（CAR-antigen）所介导的T细胞-癌细胞间的相互作用和程序性死亡受体-配体（PD-1-PD-L1）所介导的T细胞-癌细胞间的相互作用实现成功捕获，展现了邻近标记工具箱捕获细胞间相互作用的通用性；另外他们还阐述了工具箱捕获细胞间相互作用具有可定量性、高选择性和高分辨（Ru-¹O₂-hydrazide系统）等特点（图3）。值得指出的是，该系统可以实现对CD4 T细胞和不同抗原呈递细胞的特异性和异质性的解析，解决了免疫学研究中二类分子MHC多聚体和TCR多聚体难以构建的问题。

图3 邻近标记工具箱研究细胞-细胞相互作用的特点

在未来的免疫学研究中，细胞间邻近标记工具可以广泛应用于发现未知的细胞间相互作用。例如，李劼团队利用其开发的Cell-sFT探针，成功揭示了树突状细胞（DC）与B细胞间存在的强相互作用，并在邻近标记下游结合转录组测序分析阐述了DC-B细胞相互作用的机制，为将来研究人员发现更有意义的未知细胞间相互作用及机制提供了研究范式（图4）。未来的研究可以探索将邻近标记工具箱与单细胞测序分析平台相结合的可能性。这种结合可以更加方便和高效地了解介导细胞相互作用的分子信息，为人们深入理解维持正常生理过程和引起疾病发病过程中的重要细胞相互作用及其机制提供了新思路。

图4 利用细胞间邻近标记工具发现未知的细胞间相互作用。

上述研究成果以“Use of Intercellular Proximity Labeling to Quantify and Decipher Cell-cell Interactions Directed by Diversified Molecular Pairs”和“Ru(bpy)₃²⁺-Enabled Cell-Surface Photocatalytic Proximity Labeling toward More Efficient Capture of Physically Interacting Cells”为题分别发表在Science Advances和Angewandte Chemie International Editions杂志上，文章链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.add2337 和https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202303014。李劼教授为上述文章的通讯作者，化学化工学院博士生邱爽、邓涛和硕士生李皖楠为上述文章的第一作者。该工作得到国家重点研发计划（2019YFA09006600）、国家自然科学基金（21977048，92053111）、江苏省自然科学基金（BK20202004）、北京分子科学国家实验室（BNLMS202008）及南京大学卓越计划的资助。

研究人员可以根据不同的目的和需求，有针对性地从邻近标记工具箱中选择合适的工具来探究不同的细胞间相互作用。李劼团队非常乐意分享细胞间邻近标记工具，并根据具体生物应用场景协助进一步“定制”开发工具。