在生物合成途径中，形成新的碳-碳键是化合物衍生化中最重要的一步，因其可以从简单的起始分子生成复杂的有机化合物。硫解酶催化的Claisen缩合可以催化生物体形成碳-碳键，从而构建多种多样的化合物碳骨架。在催化过程中，硫解酶的底物通道对底物的结合和缩合反应起着重要作用，可以直接影响酶活。然而，底物通道如何影响β-酮硫酶的催化机制尚不清楚，这限制了底物通道的理性工程设计以提高酶的性能。因此，探索底物通道的普适性调控机制，有助于建立一种可靠、通用的提高β-酮硫酶性能工程方法，从而广泛应用于碳-碳键的形成。

该研究解析了来自褐色喜热裂孢菌的一种耐热的β-酮硫解酶Tfu_0875的晶体结构。该酶具有Cys-His-Cys催化三联体，主要由阳离子结构域、腺嘌呤结合口袋和泛酰巯基乙胺环构成狭窄的底物通道。Tfu_0875的活性结构域含有氧阴离子空穴(OAHs)来稳定底物的过渡态。然后聚焦于底物通道，通过深度学习方法(DLKcat)预测突变体们的k_cat来筛选底物通道内酶活提高的突变体。

经筛选后发现Tfu_0875阳离子域的突变体L163H酶活提高最显著，比Tfu_0875提高了313%。L163H的咪唑基团比活性中心His348的咪唑基团更接近底物乙酰辅酶A的Cα原子，且Tfu_0875^L163H的G147可以与L163H形成氢键，这与Tfu_0875中的活性中心H348和N315 (OAH1)相同。同时测量Tfu_0875^H348A和Tfu_0875^L163H/H348A的相对酶活性，结果表明Tfu_0875^L163H/H348A的相对酶活性比Tfu_0875^H348A高1.79倍，因此认为突变体L163H可以发挥与His348相同的作用，作为氢键供体帮助锚定底物。经过分子动力学模拟发现，Tfu_0875^L163H产生的氢键数量明显高于Tfu_0875，说明Tfu_0875^L163H与底物乙酰辅酶A之间存在更强的相互作用，可以更快锚定底物乙酰辅酶A，间接缩短反应时间。此外，当L163变为H163时，阳离子域的体积从69.18 ų增大到81.15 ų。

根据上述分析，该研究揭示了一个局部阳离子域设计规则(LCDMR)。将loop区域和三明治拓扑结构的α5螺旋交界处的非保守残基突变为组氨酸，通过：(1)增加阳离子结构域的体积，为底物提供更宽的反应空间；(2)增加周围残基与底物的氢键相互作用，加速Claisen缩合反应；(3)与活性中心H348功能相似，从而锚定底物稳定四面体中间体。这一规律对提高其他β-酮硫酶的酶活性具有普遍适用性。

上述研究工作中，江南大学19级博士研究生刘丽霞为论文的第一作者，邓禹教授和周胜虎副研究员为论文的共同通讯作者。此研究工作得到了国家重点研发计划(2022YFC2104600)、江苏省杰出青年基金(BK20220089)和天津市合成生物技术创新能力提升项目(TSBICIP-KJGG-015)的资助。