NIR-I（700-1000 nm）和NIR-II（1000-1700 nm）染料因其对皮肤和组织的强穿透力而在生物成像领域备受青睐。目前商用近红外染料ICG和IRdye800CW存在着生物偶联效果较差的缺陷。此外，ZW800-1作为一种近红外离子型染料，因其亲水性和肾脏代谢清除速率快等优势而被广泛应用。然而，由于ZW800-1分子骨架中亲核位点的存在导致其在生理环境下易受到生物分子的“进攻”，从而导致荧光信号丢失，不利于长时间动态示踪。下载化学加APP到你手机，更加方便，更多收获。

Scheme 1. （a）分子的设计概念和（b）化学结构

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

基于此，作者发展了设计合成NIR-I花菁染料的新方法（Scheme 1），即分子的平面骨架由2个或者4个侧链基团进行“保护”，该“双带隔离”型的共轭NIR-I和NIR-II染料表现出性能的提升。作者利用该策略合成了dsZW800-1分子，由此解决了ZW800-1的荧光信号减弱问题。此外，所合成的分子dsZW1015的吸收和发射峰位置更是达到了NIR-II发射区域，再次证明了该设计策略的通用性。最后，dsZW1015与抗体进行偶联后的探针还实现了对肿瘤小鼠的体内NIR-II成像。

Scheme 2. 中间体4和化合物dsZW800-1的合成路线

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

dsZW800-1的合成过程如Scheme 2所示。关键合成中间体是未束缚染料3，在温和的条件下通过将前体1中的4'-氯原子用含有两个末端端点为偶氮基团的酚2进行置换而组装而成。随后的皂化反应将3转化为未束缚染料4，然后通过铜催化的偶氮基-炔烃环加成反应，将两个侧链带连接起来，产率达62%。

Figure 1. （a）dsZW800-1晶体结构的侧视和端视图；（b）dsZW800-1晶体结构中的层间距

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

单晶结构侧面证实了分子内屏蔽效应的存在（Figure 1）。一般情况下，七甲川花菁染料中的滑移面分子间距在3.5-5 Å，而dsZW800-1中荧光分子的间距为9 Å。因此，在聚集态下，“双带”基团可以增大分子间距，减小染料的偶极-偶极相互作用。相比于ZW800-1而言，dsZW800-1的最大吸收和发射峰位置没有明显变化，而在水溶液中的荧光量子产率则有所提升。这也意味着“双带隔离”策略能够有效抑制染料分子与周围水环境作用所产生的非辐射跃迁过程。

Figure 2. 光照射下化合物的光稳定性数据

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

此外，作者利用氙灯照射ZW800-1、4和dsZW800-1的PBS缓冲溶液。通过实验数据可知，光学稳定性的强弱顺序依次为4 > dsZW800-1和ZW800-1（Figure 2）。4和dsZW800-1稳定性的提高得益于位阻屏蔽基团能够有效降低氧气的光敏化速率，抑制生物分子与单线态氧的相互作用。 

Figure 3. （a）ZW800-1和GSG的反应产物；（b）染料稳定性比较

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接下来，作者将三种染料与谷胱甘肽（GSH）在PBS缓冲液中进行培养。亲核基团发生反应后很容易造成花菁染料的吸收峰位置发生红移（Figure 3a）。通过采集不同培养时间下染料的发光强度可知，具有“双带隔离”保护的dsZW800-1能够十分有效地抑制分子中的亲核位点发生反应，从而降低在生理环境下探针荧光信号丢失的风险（Figure 3b）。

Figure 4. （a）室温下Pan-dsZW800-1在PBS缓冲液中的吸收光谱；（b）不同时间段Pan-dsZW800-1染料在荷瘤小鼠体内的成像信噪比；（c）小鼠的体内荧光图像；（d）小鼠体内不同器官的明场、荧光照片和（e）荧光信号分布

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者还对dsZW800-1的体内成像性能进行了考察，即将染料与Panitumumab （Pan）抗体相连。偶联抗体后的Pan-dsZW800-1的激发波长为772 nm，荧光光谱与dsZW800-1一致（Figure 4a），表明染料未发生聚集。此外，借助商用近红外体内成像装置可以看出探针在注射72 h后的成像信噪比达到8，肝脏处的荧光信号可忽略不计（Figure 4b-c）。同时，检测提取小鼠的各个脏器的荧光信号也说明Pan-dsZW800-1具有很高的肿瘤特异性（Figure 4d-e）。

Scheme 3.化合物dsZW1015的合成路线

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

为了进一步提高染料的发射波长，作者设计合成了NIR-II发射的分子dsZW1015（Scheme 3）。通过将dsZW1015中的琥珀酰亚胺酯基团与Pan相连，得到的PandsZW1015在1000 nm处表现为强吸收峰，并且没有明显的染料聚集现象（Figure 5a）。此外，在注射探针72 h后，肿瘤部位仍能保持很高的荧光信号值（Figure 5b）。实验数据再次证明了将dsZW1015与特异性抗体偶联后，探针可有效地被用于NIR-II成像当中（Figure 5c）。

Figure 5. （a）室温下Pan-dsZW1015在PBS缓冲液中的吸收光谱；（b）不同时间段Pan-dsZW1015染料在荷瘤小鼠体内的成像信噪比；（c）注射/未注射Pan-dsZW1015染料的小鼠明场和荧光图像

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

美国圣母大学Bradley D. Smith教授团队报道了一系列高性能的七甲川花菁染料。与传统NIR-I染料ZW800-1相比，dsZW800-1展现出明亮发射以及更好的化学稳定性。此外，实验数据还表明dsZW800-1更适合作为用于动态追踪的靶向探针。通过空间屏蔽和平衡电荷的结构组合，对dsZW1015中荧光染料的增强疏水性进行抵消，从而产生标记有染料的抗体，有效地用于活体小鼠的近红外II区肿瘤荧光成像。探针的理性分子设计法则也为后续“比率型”和“on-off”近红外探针的发展提供了参考。