导读

前列腺癌（PC）是一种发生于前列腺上皮的恶性肿瘤，是老年男性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。雄激素受体（AR）作为前列腺癌治疗的重要靶点之一，其持续的下游信号传导对前列腺癌细胞的生长、存活至关重要。AR结构（图1）主要由N末端转录结构域（NTD）、C末端配体结合结构域（LBD）和中央DNA结合结构域（DBD）组成。AR-V7是一种AR剪切突变体，缺少LBD结构域，在缺乏雄激素的条件下，AR-V7依然能诱导产生非配体依赖的转录，具备调节基因表达的活性，因此被认为是剪切突变体中与去势抵抗性前列腺癌（CRPC）最相关的一种亚型。因此，开发能够同时靶向AR及AR-V7的小分子药物是治疗常规与耐药型前列腺癌的一种重要途径。

近日，国际药物化学领域TOP期刊 Journal of Medicinal Chemistry （DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c00585）杂志报道中国海洋大学秦冲教授团队研究成果：提出靶向AT-NTD的PROTAC降解剂策略，设计并合成得到BWA-522可同时降解AR-FL（野生型）与AR-V7，并具有良好的口服效用，有望应用于前列腺癌的治疗。

正文

目前靶向AR的药物（图1）主要结合于LBD，如氟他胺（1）、比卡鲁胺（2）、恩杂鲁胺（3）和阿帕鲁胺（4）。此外，一些靶向其他AR结构域的拮抗剂也被报道，化合物5可高效靶向AR-DBD，其IC50 ~ 0.1 μM。EPI-002（6）是从海绵中分离出来的双酚A衍生物，被证明通过结合AR-NTD来阻止AR转录活性。其前药EPI-506（7）于2015年进入I期临床试验，但因药效不足，代谢水平较差，限制了其进一步的临床试验。

图1 AR及突变体蛋白结构与AR拮抗剂的化学结构(图片来源：J. Med. Chem.)

蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）是另一种有前景的双功能分子，它通过劫持细胞中泛素-蛋白酶体系统（UPS）来诱导靶蛋白的泛素化，随后通过蛋白酶体降解（图2）。虽然许多AR-LBD PROTAC（图2）已经成功地实现了AR的降解，但这些PROTAC针对AR-V7的降解效力仍然较弱。秦冲教授团队最近报道的AR拮抗剂-Hsp90抑制剂偶联物，能同时诱导AR和AR-V7降解，并能够实现肿瘤靶向性，具备进一步开发为候选药物的潜力（J. Med. Chem. 2023, 66, 7, 4784–4801. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01970）。由于靶向AR-NTD的PROTACs能够同时结合并降解AR-FL和AR-V7，消除其功能，在治疗PC和CRPC中具备临床价值。 综上，研究人员开展了首个靶向AR-NTD的PROTAC设计、合成和生物学评价的研究。下载化学加APP到你手机，更加方便，更多收获。

基于PROTAC分子结构（图3），研究人员选择EPI-002作为靶蛋白配体，E3连接酶VHL与CRBN的配体作为招募E3配体，通过不同Linker将两部分连接。为了在连接结构时不影响配体结合效率，研究人员分析了NTD抑制剂EPI-002的结合方式（图3），选择处在溶剂暴露区的丙二醇片段作为接出位点，连接Linker与E3连接酶配体。

图2 代表性AR PROTAC的化学结构(图片来源：J. Med. Chem.)

图3 AR-NTD PROTACs的设计(图片来源：J. Med. Chem.)

在活性初筛阶段，研究人员首先利用Click反应，合成了三个具有不同长度Linker的AR-NTD PROTACs（13-15）。通过Western blotting分析LNCaP和VCaP中AR-FL和AR-V7蛋白水平。结果显示（表1），化合物13-15在两种前列腺癌细胞株中，仅能降低17.6-53.5%的AR-FL。

接下来，研究人员将E3连接酶配体换为沙利度胺，设计合成了具有柔性和半刚性Linker的PROTACs（16-24）。降解数据显示（表2），基于CRBN配体的PROTACs相比于VHL配体对AR-FL与AR-V7的降解活性更高，其中含有半刚性Linker的化合物 24的降解活性最强，1 μM和5 μM化合物在VCaP细胞中可诱导AR-FL分别降低22.6%和49.3%，AR-V7分别降低54.4%和75.7%。

表1. 柔性Linker的VHL配体的降解活性研究(图片来源：J. Med. Chem.)

表2. 柔性与半刚性Linker的CRBN配体的降解活性研究(图片来源：J. Med. Chem.)

刚性Linker的构象限制有助于PROTACs形成稳定的三元复合物，从而显著提高降解活性。因此，研究人员利用四元或六元杂环片段设计了具有刚性Linker的化合物25-34（表3）。在LNCaP细胞中，化合物28（BWA-522）在1 μM和5 μM下分别降低了48.7%和72.0%的AR-FL。而在VCaP细胞中，BWA-522对AR-FL和AR-V7的显示出较强降解活性，在1 μM和5 μM下诱导AR-FL和AR-V7分别降低了52.4、73.1%和77.3、84.6%。

最后，研究人员将化合物25-34中沙利度胺的苯环的连接位置从间位改为邻位，合成了化合物35-44（表4）。Western blotting结果显示， LNCaP细胞中，这些化合物诱导AR-FL蛋白水降解效果大多优于相应的间位取代化合物。活性最高化合物39在LNCaP细胞中分别诱导降低了13.9%（1 μM）和62.4%（5 μM）的AR-FL。在VCaP细胞中，给药浓度1 μM和5 μM时，39诱导AR-FL分别降低44.3%和57.2%，诱导AR-V7分别降低37.1和72.7%。

表3. 刚性Linker的CRBN配体的降解活性研究(图片来源：J. Med. Chem.)

表4. 不同取代位置刚性Linker的CRBN配体的降解活性研究(图片来源：J. Med. Chem.)

研究人员选择初筛活性较好的的化合物24、BWA-522与39在小鼠中进行PK测试（表5）。经2 mg/kg静脉给药后，化合物BWA-522的AUC最高为3018 h·ng/mL，且血浆清除率较低为594 mL/h/kg。同时，研究人员还比较了三个化合物口服效率，发现化合物BWA-522具有极好的口服血浆暴露，AUC值为5947 h·ng/ml，优于化合物24与39。化合物BWA-522的口服生物利用度为40.5%，而化合物24和39的口服生物利用度分别仅为7.8%和12.3%。

表5. 化合物24、BWA-522和39在小鼠体内的PK数据(图片来源：J. Med. Chem.)

鉴于BWA-522在小鼠中的良好口服利用度，我们进一步评估了其在比格犬中的PK（表6）。当口服剂量为5 mg/kg时，BWA-522的t1/2为31.2 h，口服生物利用度为69.3%。这些结果共同表明BWA-522是一种具备口服活性PROTAC分子。

表6. 化合物BWA-522在比格犬体内的PK数据(来源：J. Med. Chem.)

研究人员选择BWA-522在LNCaP、VCaP和22Rv1三种前列腺癌细胞系进行详细的Western blotting检测。其中22Rv1是一种CRPC细胞系，并对恩杂鲁胺耐药。结果显示（图4），BWA-522显著降低了3种细胞系中AR-FL和AR-V7的水平，并呈现出良好的时间与剂量依赖性。BWA-522诱导LNCaP、VCaP和22Rv1细胞中AR-FL蛋白降解，其DC50分别为3.45、0.73和2.41 μM（图4D）。它在VCaP和22Rv1细胞中也实现了AR-V7蛋白的高效降解，其DC50分别为0.67和0.76 μM（图4E）。

图4 前列腺癌细胞系AR-FL或AR-V7蛋白的Western blotting分析(图片来源：J. Med. Chem.)

接下来，研究人员研究BWA-522在前列腺癌细胞系中的降解机制。在BWA-522处理前，分别用蛋白酶体抑制剂MG132（3 μM）、活化E1酶抑制剂MLN4924 （1 μM）和CRBN配体沙利度胺（100 μM）预处理细胞。结果显示BWA-522降解效果明显减弱（图5），证明BWA-522对AR-FL和AR-V7的降解依赖细胞中的泛素-蛋白酶体系统。

图5 BWA-522降解AR-FL及AR-V7的作用机理(图片来源：J. Med. Chem.)

AR及其变体在调节AR依赖性前列腺癌细胞的增殖中起着至关重要的作用，因此研究人员测试了BWA-522在LNCaP、VCaP和22Rv1细胞中的抗增殖能力。如图6所示，BWA-522在LNCaP和VCaP细胞中的IC50值分别为1.07和5.59 μM。同时，BWA-522能有效抑制恩杂鲁胺耐药细胞22Rv1的生长，IC50值为4.08 μM。研究人员还在LNCaP和22Rv1细胞系中进行了克隆形成实验，以评估药物对细胞增殖的长期抑制作用。与细胞增殖抑制测定结果一致，BWA-522以剂量依赖的方式减少了这两种细胞系的集落形成（图7）。

图6 BWA-522对前列腺癌细胞的抗增殖活性(图片来源：J. Med. Chem.)

图7 BWA-522抑制前列腺癌细胞的克隆形成(图片来源：J. Med. Chem.)

为了研究对AR信号通路的影响，研究人员测试了BWA-522在LNCaP（图8A）和VCaP（图8B）细胞中能否抑制AR下游蛋白表达。结果显示BWA-522能剂量依赖性地抑制两种细胞系TMPRSS2、FKBP51和PSA蛋白水平。

图8 BWA-522对AR信号通路的影响(图片来源：J. Med. Chem.)

研究人员评估了口服BWA-522对LNCaP异种移植肿瘤模型小鼠的抗肿瘤呢能力。结果显示（图9），两种给药剂量的BWA-522均能有效抑制肿瘤的生长。治疗结束时，与对照组相比，口服20和60 mg/kg BWA-522对肿瘤生长的抑制作用分别为26%和76%，表现出优于AR拮抗剂EPI-002（180 mg/kg，PO）的肿瘤抑制活性。此外，研究人员还进行了BWA-522毒理研究，以评估其在ICR小鼠中的潜在副作用。BWA-522以20和60 mg/kg的剂量每日口服给药，连续14天。在治疗结束时，两剂量组均未观察到明显的动物体重减轻或器官损伤，表明BWA-522在体内具有良好的体内耐受性。

最后，研究人员评估了BWA-522体外一些成药特性。结果显示，该化合物在人或鼠的肝微粒体与血浆中都保持了较好的稳定性，并无明显hERG毒性。

图9 BWA-522对LNCaP异种移植瘤模型小鼠的抗肿瘤活性研究(图片来源：J. Med. Chem.)

总结

综上，秦冲教授课题组发现的化合物BWA-522，是一种有效的口服生物可利用的AR-NTD PROTAC降解剂，有望成为治疗AR-FL和AR-V7依赖性肿瘤的候选药物。

该工作特别致谢中国海洋大学和青岛海洋科学与技术国家实验室的支持。中国海洋大学博士研究生张博闻，硕士研究生刘畅、杨振乾和工程师张赛为该论文共同第一作者，秦冲教授为通讯作者。该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金及山东省自然科学基金优秀青年基金等项目的资助。

课题组简介

课题组研究方向为：

（1）基于靶向蛋白降解（PR OTACs）策略的小分子先导化合物发现和新药发现；

（2）去势抵抗性前列腺癌治疗药物研究；

（3）海洋天然活性物质的结构多样性修饰及成药性优化。

课题组近期成果介绍：

（1）秦冲教授团队联合浙江大学药学院高建青教授团队设计制备了一种载有雄激素受体PROTAC化学药物的微针贴片，通过降解毛囊内的雄激素受体来实现毛发再生。

在AGA治疗实验中，与每日使用的阳性对照米诺地尔相比，该微针贴片只需一次给药即可达到质量相当的毛发再生，且再生速度更快。同时该微针在停药后仍能维持药效，在再复发模型上仍能实现高质量的毛发再生，有望克服临床治疗手段停药后易复发的缺陷。 （Small Methods, 2023, 7(1):e2201293. doi: 10.1002/smtd.202201293. IF=14.188）

（2）秦冲教授团队评估了新型BET降解剂QCA570在多种膀胱癌细胞中的生物学功能，并探讨其潜在机制。

QCA570在纳摩尔浓度下可诱导BRD4蛋白降解，其DC50约为1 nM。QCA570可以通过转录抑制和诱导靶蛋白降解进而降低EZH2和c-MYC表达水平。此外，QCA570显著诱导细胞凋亡和周期阻滞，对膀胱癌细胞具有潜在疗效。 （Front Chem, 2023, 11:1 121724. doi: 10.3389/fchem.2023.1121724. IF=5.545）

（3）秦冲教授团队报道了一类新型AR拮抗剂-Hsp90抑制剂偶联分子的最新研究进展，该分子不仅可以提升药物的肿瘤靶向，减少不必要的毒副作用，还可以通过AR和Hsp90的双靶点协同抑制，达到提升药效和克服CRPC耐药的目的。（J. Med. Chem. 2023, 66, 7, 4784–4801. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01970. IF=7.3）

导师介绍

秦冲博士 ，中国海洋大学教授、博士生导师，青岛海洋生物医药研究院副院长。2010年毕业于中国农业大学应用化学专业，获学士学位；2015年毕业于北京大学药物化学专业，获博士学位（导师：焦宁教授）；2016-2019年在美国密歇根大学从事博士后研究（导师：王少萌教授）；2019年回国后在中国海洋大学独立开展研究工作，主持国家高层次青年人才项目（2021）、国家重点研发计划青年科学家项目（2022）、国家自然基金青年基金（2021）、山东省“泰山学者”青年专家（2020）、山东省自然基金优秀青年基金（2021）等研究项目，获北京市自然科学奖一等奖（2019）。

近年来在 J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Small. Methods.、 J. Med. Chem. 等杂志发表学术论文20余篇，申请国际发明专利十余项。

联系方式：qc@ouc.edu.cn。

文献详情：

Bowen Zhang, Chang Liu, Zhenqian Yang, Sai Zhang, Xiaolin Hu, Baohu Li, Mei Mao, Xiao Wang, Zhuoyue Li, Shumin Ma, Siqi Zhang, and Chong Qin*. Discovery of BWA-522, a First-in-Class and Orally Bioavailable PROTAC Degrader of the Androgen Receptor Targeting N-Terminal Domain for the Treatment of Prostate Cancer. J. Med. Chem.2023,https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c00585