人类中超过30%的编码蛋白质的基因表达细胞外或细胞表面蛋白质。其中许多蛋白在各种病理生理条件下发挥着关键作用。近年来，靶向蛋白降解（TPD）技术已成为靶向传统不可成药蛋白的新型高效治疗方式。然而，大多数TPD相关策略，包括PROTAC、分子胶和AUTAC等，只能降解胞质蛋白或具有胞质结构域的膜蛋白。在此，作者报道了iLYTACs，并通过一系列实验证实了iLYTAC可以用于扩展当前LYTAC和相关技术的潜在应用。下载化学加APP到你手机，更加方便，更多收获。

(图片来源：J. Am. Chem. Soc.)

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IGF2R结构域11特异性结合IGF2。结合后，IGF2–IGF2R复合物经历细胞运输进入溶酶体，最终导致IGF2降解。作者首先验证了IGF2的这种特殊性质可以被用作一种有效的溶酶体靶向受体（LTR）配体，以实现细胞外和膜蛋白的广泛有效的溶酶体递送和降解（图1A、B和S1）。在概念验证实验中，作者证实了细胞外生物素结合蛋白NeutrAvidin protein DyLight 650/488（NA650/NA488，图1C和S2）的成功细胞摄取和溶酶体递送。细胞的蛋白质组裂解物的凝胶内荧光扫描分析显示，IGF2介导的NA488摄取与时间相关，显著摄取在2小时开始发生，并持续24小时（图S2C），且在洗出后2小时明显观察到NA488带的荧光强度显著降低，表明NA488的溶酶体降解成功。

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随后，作者试图将基于IGF2的iLYTAC建立为一个通用、方便和模块化的平台（图1D）。I型iLYTACs是IGF2与POI结合物或纳米体融合的产物，即IGF2-TB。II型iLYTAC（也称为IGF2-Z）是免疫球蛋白G（IgG）的Z结构域与IGF2融合，从而能够融合大多数市售mAb（图1E）。作者总共构建了四种I型iLYTACs，即IGF2-Af_EGFR、IGF2-Af_Syn、IGF2-Nb_GFP和IGF2-Nb_PDL1。

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接下来，作者进行了BLI实验，确证了iLYTACs中的IGF2仍保持对IGF2R的结合活性（图2E和S7）。用LysoTracker Green对IGF2-TB处理的细胞进行的进一步共定位实验显示，大多数内化的IGF2-TB的溶酶体定位成功（图2I和S8C）。作者在K562和HeLa细胞中用IGF2-Af_EGFR进行了竞争摄取测定（图S9A），进一步验证了IGF2/IGF2R辅助摄取IGF2-TB。

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接下来，作者确证了iLYTACs能够介导疾病相关的细胞外蛋白和膜蛋白的溶酶体降解（图3A–D和S10A，B）。此外，添加了溶酶体抑制剂Baf和氯喹CQ后显著抑制了EGFR降解，进一步证实了溶酶体降解机制（图3E）。作者进一步评估了IGF2-Af_EGFR如何影响EGFR的下游信号传导。急性EGF刺激（100 ng/mL，20分钟）没有降低EGFR水平，但显著增强了磷酸化（图3F，泳道2）。单独用IGF2或Af_EGFR预处理没有改变EGF刺激后EGFR的Y1068的磷酸化状态（图3F，泳道3和4）。然而，作者观察到pEGFR表达在IGF2-Af_EGFR处理的细胞中显著减少（图3F，泳道5），这表明与西妥昔单抗（Cet）/Af_EGFR结合相比，IGF2-AfEGFR去除EGFR在抑制下游激酶信号传导方面更有效。

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为了进一步验证iLYTACs的普适性和灵活性，作者接下来设计并得到了靶向PD-L1的iLYTACs IGF2-Nb_PDL1和IGF2-3-Nb_PDL1。观察到了与IGF2-Af_EGFR类似的效果（图3G、H、S10D和S8D）。

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随后，作者进一步评估了iLYTAC介导的细胞外蛋白降解。GFP和α-Syn被用作靶向蛋白；相应的iLYTAC IGF2-Nb_GFP (图 4A，4B）和IGF2-Af_Syn（图4C，D）均对GFP和α-Syn表现出降解能力。

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随后，为了探索在II型iLYTAC（或IGF2-Z）的基础上开发通用降解平台的可能性，作者使用类似于生产I型iLYTACs的方法将IGF2-Z在大肠杆菌中表达、纯化并表征（图5A和S3–S8）。

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接下来，作者评估了IGF2-Z与Cet联合是否可以降解内源性EGFR（图5E和S13A，B）；WB分析显示，与Cet和IGF2-Z共同孵育的HeLa细胞内的EGFR水平以剂量和时间依赖的方式显著降低，在用摩尔比1:10 Cet/IGF2-Z 24小时孵育处理的细胞中观察到有效的EGFR降解。IGF2和Z结构域之间的连接体的长度不影响降解效率（图S13C）。这种降解被溶酶体抑制剂抑制（图5F）。免疫荧光和CLSM显示，在用Cet+IGF2-Z处理的细胞中，膜结合的EGFR信号成功地输送到主要的溶酶体（图5G）。与用IGF2-Af_EGFR处理细胞的I型iLYTAC相比（图3B–F），作者观察到在EGF刺激后，用Cet+IGF2-Z处理的HeLa细胞中pEGFR和pAKT（S473；EGFR的下游靶标）的水平更显著地降低（图5H）。

为了进一步验证IGF2-Z的普适性，作者研究了IGF2-Z降解CD20的能力。结果发现，用IGF2-Z+Ritu处理Raji细胞后，比单独用Ritu或IGF2-Z处理的细胞的CD20水平低得多（图5I和S13E）。

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随后，作者选择IGF2-Z来评估其在小鼠中的药代动力学和生物分布。静脉注射Cy5标记的IGF2-Z、Cet和Cy5（图S14A）。基于处理小鼠尾血中荧光强度的清除率显示，仅使用Cy5染料的清除率最快，其次是IGF2-Z，最后是Cet（图6A），这与分子大小影响药代动力学的已知现象一致。主要器官的离体荧光成像也显示出类似的清除趋势（图S14B–D）；IGF2-Z与Cet的复合物形成并没有显著影响IGF2-Z的清除率，这可能是由于血液中IgG水平高得多。此外，在IGF2-Z或Cet-5-h处理的小鼠中，观察到肝脏的摄取最高。5小时时在肾脏中检测到强烈信号，表明IGF2-Z正在迅速从血液循环中清除（图6B和S14D）。

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随后，作者使用HeLa细胞异种移植的Balb/c裸鼠，在体内评估iLYTACs的治疗潜力。结果表明，用IGF2-Z+Cet治疗的小鼠的肿瘤体积和重量下降了～50%，而用IGF2-Af_EGFR治疗的小鼠肿瘤体积和体重下降水平略低（图6E和F）。WB结果也表明通过使用iLYTAC，体内EGFR成功降解（图6G/H）。