（图片来源：Nat. Chem.）

接下来，作者又合成了含吲哚基团的骨架5，6，7a-d和桥联基团8，又经过两步合成得到了5-endo-trig型Cy5衍生物2a和2b。同时，5-exo-trig型Cy5衍生物4a和4b可以经甲基酯中间体和LiAlH₄还原两步合成得到（Fig.2a）。为了评价关环异构体的稳定性，作者对Cy5衍生物进行了pH滴定（Fig.2b）。实验结果表明5-endo-trig型探针游离在细胞中能够表现出明亮的发光，而5-exo-trig型探针在酸性环境中才会发光。在活细胞成像中，5-endo-trig型探针2a和2b在线粒体中表现出明亮的荧光（Fig.2c）。此外，作者合成了靶向性探针11（Fig.2d）。该染料的吸光度增加了约10倍，当与纯化的SNAP-tag蛋白培育后其荧光强度提升了21倍（Fig.2e），由此可证明在与自标记标签蛋白结合后染料的荧光性能增强。后续的实验表明探针11还具有自发闪烁特性，从而可被用于对细胞微管结构的单分子超分辨成像当中（Fig.2f）。

（图片来源：Nat. Chem.）

作者又利用5-endo-trig策略合成含吲哚基团的化合物13和Cy5探针14（Fig.3a）。将含炔的衍生物与苄基鸟嘌呤10进行偶联后可得探针15和16（Fig.3b）。染料15与纯化后的SNAP-tag蛋白培育后吸光度增强了19倍，荧光强度增强了19倍。对比之下，染料16的吸光度和荧光强度分别提高了1.4倍和2.5倍（Fig.3c），探针15则与JF646系列染料的荧光性能相当。此外，作者验证了染料15、16和JF646是否可以作为免洗探针用于活细胞成像。荧光成像结果表明探针15和JF646的表现相当（Fig.3d）。作者还制备了肌动蛋白靶向的探针17-actin和DNA靶向探针18-DNA（Fig.3e, f）。体外实验中，探针17与肌动蛋白结合后的吸光度增加了11倍，荧光强度提升了313倍。活细胞成像中探针17更是能选择性靶向HeLa细胞中的肌动蛋白。同时，探针18与DNA结合后的吸光度增加了7倍，荧光强度提升了32倍。以上结果表明经5-endo-trig策略合成的Cy5衍生物可进行多种靶向性修饰后用于生物成像。

（图片来源：Nat. Chem.）

最后，作者合成了Cy3的衍生物19和Cy7的衍生物20用于标记SNAP-tag（Fig.4a），探针19和20在与该蛋白结合后吸光度分别提升了6倍和11倍，荧光强度分别增加了28倍和124倍（Fig.4b）。此外，探针15，19和20的发射光谱覆盖一部分可见光区并延伸到了近红外区域。在与SNAP-tag结合后探针15和20表现出明亮的发光和良好的光学稳定性（Fig.4c, d）。此外，作者结合使用Cy5染料15和JF549-Halo染料用于多路复合成像当中（Fig.4e）。如Fig.4e 所示，Cy3衍生物19和JF549-Halo的激发和发射波长范围相近，作者利用其激发态寿命的差异对其进行了荧光寿命成像（FLIM）。成像结果表明尽管两种探针的波长相近，但是基于染料19（激发态寿命2 ns）和染料JF549-Halo（激发态寿命4 ns）寿命的不同，仍可以对其发光信号进行分离（Fig.4f, g）。

（图片来源：Nat. Chem.）