Alkylidene环丙烷是一类天然的和合成的张力环化合物（Figure 1a），其烯烃部分可以发生转化，且取代基之间具有不寻常的立体化学和几何关系。单取代的联烯与非对称卡宾的环丙烷化可以产生八种异构体产物（Figure 1b），并且由于联烯的特性使得它们的立体选择性环丙烷化具有很大的挑战。首先，由于中心缺电子的sp碳降低了联烯的亲核性，因此联烯在环丙烷化反应中比烯烃的反应性差；其次，与末端联烯中的端位烯烃反应在空间上是有利的，而与内部烯烃反应在电性上有利；再次，1,1-二取代非对称联烯中的端位烯烃的两个面是非对映异构的，从而导致产物的不同(E)-和(Z)-构型。因此，尽管ACPs的立体化学研究已有丰富的历史，但目前仅报道了5例ee > 90%的非手性联烯的对映选择性环丙化反应，且这5例是通过使用空间位阻较大的卡宾或含有第二个结合位点的金属和过量的联烯来克服上述挑战的（Figure 1c）。由于很少有联烯是商业可得的，因此对有限的联烯实现选择性环丙烷化反应具有重要意义。然而，通过联烯的分子间对映选择性环丙化形成(Z)-异构体主要产物到目前还是未知的。最近，美国加州大学伯克利分校John F. Hartwig课题组报道了一个通过定向进化的Ir(Me)-CYP119变体催化联烯与EDA的区域选择性环丙烷化，形成了具有优异对映选择性的(E)-或(Z)-异构体（Figure 1d）。下载化学加APP到你手机，收获更多商业合作机会。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

首先，作者以苯基联烯和EDA作为模板底物对反应进行探索（Figure 2）。通过对酶活性位点的8个位置（V151, A152, L205, I208, A209, G213, P253, L354）进行筛选（Figure 2a），得到的最佳反应条件为：EDA (50 mM)，E . coli harboring, CYP_variant (4 uM [Ir]), M9-N缓冲液，室温反应6小时。且当使用CYP_E‑plus可以以> 99%的ee得到E-(−)-ACP异构体。此外，使用纯化的CYP_E‑plus酶在1 mmol的规模上制备E-(−)-ACP时，产率为69% (909 TON)，ee值为97%，且1a/1b/1c的比例为97:1:2。并且E-(−)-ACP异构体通过X-射线晶体学测定得出其为(R)-对映体（Figure 2b）。

接下来，作者还通过靶向活性位点的四个额外位点来寻找能够形成(Z)-异构体的突变体（Figure 3）。当使用CYP_Z‑minus时，可以以高达94%的ee, 28:72 E/Z得到Z式异构体产物。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

在确定了突变体可以对(E)-(+)、(E)-(−)和(Z)-(−)立体异构体进行选择性识别后，作者研究了联烯取代基对立体选择性的影响（Figure 4）。CYP_E‑plus对芳基-ACPs中芳基上的小位阻取代基如氟、甲基、甲氧基和氯具有良好的耐受性(97% ~ 99% ee)。而芳基上位阻较大的取代基如正丙基、溴和叔丁基会使ee值有小幅度的降低(分别为96% ee、92% ee和87% ee)。此外，具有更柔性的正己基和苯乙基的脂肪族ACPs也可以以良好的对映选择性形成环丙烷。

为了评估控制立体选择性的因素，作者进行了DFT计算和MD（molecular dynamics）模拟（Figure 5）。首先，作者对游离的、非取代的Ir(Me)-卟啉络合物催化联烯1的反应进行了DFT计算，揭示了辅助因子对苯基联烯环丙烷化的内在选择性。DFT计算表明端位双键和内部双键通过环丙烷化形成的E-或Z-异构体的过渡态能量均在1 kcal·mol⁻¹左右。最低能量过渡态（ΔG^‡为4.6 kcal·mol⁻¹）导致(E)-ACP产物的生成，且其为主要的烯烃异构体，但由于计算所得到的ΔG^‡差异很小，由此表明进化的酶的选择性主要由与活性位点氨基酸侧链的相互作用所控制。由于这些模型的ΔG^‡值较低(4.6-5.7 kcal·mol⁻¹)，因此反映了Ir-卡宾中间体对联烯的高反应活性。接下来，作者通过MD模拟表明，在CYP_{E - plus}变体中，由于Gly在213位被Leu取代，卡宾在Ir-C键周围旋转了大约100^o。此外，结合联烯的MD模拟表明，末端烯烃以一种类似于DFT优化的(E)-(−)-ACP-TS构象接近CYP_Z‑minus活性位点的卡宾。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）